第十一章遗传物质的分子基础课件.pptVIP

改良植物抗虫植物抗除草剂植物1996年开始转基因作物投入生产2003年，抗虫作物1000万hm2抗除草剂作物5000万hm2美国转基因棉花80％；全球50％我国进口的大豆绝大部分是转基因大豆粘粒（cosmid）载体（45kb）细菌人工染色体BAC（300kb）

bacterialartificialchromosome来源于F因子酵母菌人工染色体YAC（1Mb）

yeastartificialchromosomeTi质粒Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质双链闭合环状DNA，150～200kb植物基因工程常用的载体Ti质粒结构T-DNATransferDNA是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNAT-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区LB；RB在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞三.基因的分离与鉴定从基因库中分离基因聚合酶链式反应(PCR)扩增基因人工合成基因T－DNA标签法基因组文库GenomicDNAlibrary使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体这个群体包含全基因组的遗传信息cDNA文库cDNAlibrary以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)将双链cDNA与适当载体连接转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库基因组文库与cDNA文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列分离特定基因，cDNA库比较方便研究调控序列，必须基因组文库从基因库中筛选特定的克隆一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件。最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库DNA探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸单链、双链同位素标记、荧光标记、颜色标记筛选文库质粒基因库筛选细菌混合液在培养在平板上转移到尼龙膜上裂解细菌变性DNA标记探针杂交漂洗放射自显影或荧光检测挑取对应菌落、培养抽提质粒阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因测序自动测序仪功能分析预测软件(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因利用PCR方法可以在数小时内使目的DNA片段扩增到数百万个拷贝。基本原理：根据待扩增基因的部分序列合成成对引物，在体外合成两个引物之间的DNA序列。聚合酶链式反应

(PCR，polymerasechainreaction)PCR方法已成为分子生物学研究常规手段而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑发明人获得了1993年诺贝尔化学奖（三）人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测DNA序列将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。（四）T－DNA标签克隆基因利用T－DNA插入创造突变体获得突变体的纯合材料分析突变体性状与T－DNA的共分离关系PCR获得T－DNA的侧翼基因组序列用所得序列作探针筛选基因文库，获得目标基因或克隆再作进一步的分析三、重组DNA分子的构建用相同的内切酶酶解目的基因与载体将载体与目的基因混合用DNAligase连接重组DNA分子的构建四、外源基因导入宿主细胞将目的基因与载体连接，构建重组DNA分子重组DNA分子必须导入宿主细胞才能扩增或表达1.重组DNA导入原核生物原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌导入方式多用转化法也有用结合的方法2.重组DNA导入植物（1）、根癌农杆菌转化技术（2）、基因枪法根癌农杆菌转化技术根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。双子叶植物、单子叶植物都可以用。将目的基因与花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子组成嵌合DNA分子插入到Ti衍生质粒的RB与LB之间构成重组质粒