第十一章电泳分离技术课件.pptVIP

银染法机制：将蛋白质带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使银颗粒沉积在蛋白带上。银染蛋白的吸光度与他们的浓度成线性关系。蛋白质的染色程度与蛋白质上的特殊基团有关，碱性和含硫氨基酸的存在对染色有贡献。银染应先固定，固定的作用有两个：第一是把蛋白质固定在凝胶中阻止扩散。第二为了除去干扰染色的物质，如去污剂、还原试剂和缓冲液中的成分（甘氨酸）。固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。染色分为双胺银染和非双胺银染。银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。双胺银染过程：1.胶在50%甲醇中浸泡至少1小时.2.配制溶液A0.8克硝酸银到4毫升无离子水。B21毫升0.36%氢氧化钠和1.4毫升14.8摩尔的氢氧化胺.3.将A滴到B中，用无离子水加至100毫升，此溶液临用前配制，染色15分钟.4.无离子水漂洗5分钟.5.显色液：2.5毫升1%柠檬酸与0.25毫升37%甲醛混合，加无离子水至500毫升。显色约10分钟，蛋白带出现。6.无离子水漂洗后用50%甲醇终止显色。十二烷基硫酸钠（SDS）的聚丙酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是SDS能和蛋白质结合并使蛋白质带有大量的负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别消除；同时通过断裂分子内和分子间的氢键，蛋白质的结构也在SDS作用下变得松散，形状趋于一致。排除了电泳过程中电荷的影响，使SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。原理在一定范围内，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。测定蛋白质相对分子质量时，用已知相对分子质量的蛋白质与被测样品在同一条件下进行电泳，最后计算出被测样品的分子量。由于蛋白质与SDS的结合对电泳影响显著，因此需要注意SDS单体浓度、离子强度等影响因素。用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。蛋白质Z在左边的native中无法向下泳动，但在右边的SDS则可以依其分子量正确泳动；因此一般使用上，SDS的应用较广泛。在SDS下，虽然X分子被解析成单元体，因此分子量由160kD变成40kD；但若在较温和的样本处理件下，有可能看到未完全解析的160kD蛋白质色带。StakinggelSeparatinggel该方法可选择的缓冲液范围较广，主要影响蛋白质分离效率和电泳速度。由于无电荷浓度的影响，因此凝胶浓度选择成为关键因素。等电聚焦等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。第十一章电泳分离技术广泛应用于各个科学领域的新型分离技术概述在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因而逐渐发展起了区带电泳。自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越来越广泛的应用。电泳分析的特点各种电泳技术具有如下特点：凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进行定性或定量分析；样品量极少；设备简单，可在常温下进行；操作简单省时；分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。2