第五章鱼精的利用课件.ppt

第五章鱼精的利用自鱼精中提取DNA-Na鱼精蛋白一、自鱼精中提取DNA-Na（一）、概述DNA及其钠盐（DNA-Na）是遗传工程研究的重要材料，也是常用的生化试剂和医药制品的原料。由DNA降解而成的5′—脱氧核甘酸，在遗传工程上可用来合成一级结构模拟药物，在临床上能控制一些贵遗传复制失调的疾病；在医药学上，可作为类抗病毒物，能起到调节细胞功能，对治疗急慢性肝炎、肾炎、肌肉萎缩、心血压计管病、血小板减少症和白血球减少症均有一定疗效；还可作为一类抗癌新药畏助应用于临床。DNA的制备历史：在五十年代是Zamenhoff等用不同方法从生产牛肉膏的下脚料小牛胸腺中提取的，后来牛肉膏被蛋白胨取而代之。人们开始不断地探寻新的生产原料和方法。/国外亲从各种微生物中分离制取过DNA，但由于原料来源不便，未能广泛采用。1972年德国专利报告了鲱鱼精巢DNA的制备。在我国，早在1958年，中国科学院、上海鱼品厂等就以黄鱼精巢为原料制取了DNA-Na。80年代前后，浙江水产学院分别由鲐鱼、蓝圆鲹、大黄鱼和马面的精巢中提取了DNA-Na，并对其制备工艺进行了成功的筛选研究。（二）、原料制备DNA的原料应该符合下列几个条件：1、DNA含量高而且不源方便；2、原料内活性去氧化核糖核酸酶的含量应该低，否则在原料贮藏及制备过程中，引起DNA的解聚作用；3、原料中其它杂质，如RNA、杂蛋白质及碳水化合物等含量要少，否则使提纯过程延长；4、DNA与蛋白质之间的结合强度应该是较弱的，否则难以分离DNA与蛋白质，在用变性剂去蛋白质时，往往要重复多次主能把蛋白除尽。多年来的实践证明，除了犊牛胸腺外，水产品中，淡水鱼，鱼等精巢均是较理想的原料，其次为蓝圆、大黄鱼和马面鱼精巢。根据上面四个原则，很自然地提出了对原料新鲜度的要求，因为新鲜的才不会被解聚。而要想达到DNA含量高的要求，则必须在适当的生长时期采集，并且要设法抑制Dnase的解聚活力。工艺流程原料→匀浆→搅拌→酚法变性→静置→离心或过滤→用5%SDS与CHCL3作第二次变性→离心或过滤→析出DNANa纤维→洗涤→真空干燥→产品检验→成品及其包装操作要点：1、原料处理对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。2、匀浆以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M柠檬酸三钠溶液）比为1:3加入高盐液，以12000r/min×1′45″匀浆。3、第一次变性以原料与酚饱和溶液比为1：0.8后加速离心（3200r/min×30′）4、第二次变性取上述离心后的上清液稀释至20-30倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其1/9体程（以20倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS，CHCL3=1：2），同时加入固体NaCL，使整个体系氯化钠浓度保持1M。搅拌变性1h后，静置6-12h，离心。5、DNA-Na的析出、洗涤和干燥将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入1倍体积的95%乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的DNA-Na就析出，将析出的DNA-Na依次用95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用P2O5进行真空干燥。（四）、5′-脱氧核酸的分离与精制工艺流程：鱼精DNA-Na→配成1%（w/v）溶液→100℃沸水浴热变性10分钟→速冷→72℃±0.5酶解1.5h升温至100℃，10min→速冻→过滤→滤液（测酶解率）→上201×8柱（同时脱氧核苷等穿漏）→用不同洗脱液脱分离（洗脱顺序为DcmpdAMPTMPdGMP）→收集的各种洗脱液用炭柱浓缩→一级真空浓缩→冷冻升华干燥→两级真空浓缩→用冷酒精析出→洗涤→结晶→真空干燥→结晶成品→成品检验。方法要点1、核酸酶P1用P.citrinumM71经紫外线变异筛选后的菌株，采用液体培养制得的，滤过液酶活每ml对DNA在100单位上下，对RNA为300多单位。2、酶解反应取定量热变性DNA-Na液，以0.1NHCL调Ph5.0±0.1，72℃预热，加Ph5.0±0.1的0.2MHAL-Ma液5%（v/v），加0.05MZnCL20.028%(v/v),酶解时DNA-Na浓度为0.5%-0.1%,加酶液（1mgNAD-Na,酶活10u）,计时并始终维持72℃±0.5℃1.5h,煮沸10min终止酶反应，急冷至室温。过滤后，用5%氨水调pH8-9，再过滤后作上清液检验（用磺基水杨酸检查去沉淀程度）并作纸层析鉴定，余者低温贮藏待用。3、离子交换柱层