人教版生物选修153血红蛋白的提取和分离40PPT.pptx

学习目标1.说出凝胶色谱法的原理和方法。2.理解电泳法的基本原理及种类。3.尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。

形状和大小电荷亲和力基础知识

分配色谱法相对分子质量的大小多孔球体多糖类化合物贯穿的通道不能较短较慢基础知识凝胶色谱法和电泳法

凝胶色谱法分离蛋白质的原理混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动

凝胶色谱法分离蛋白质的过程

带电粒子迁移可解离的基团正电负电相反带电性质的差异大小形状迁移速度琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶基础知识

琼脂糖凝胶电泳示意图在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图

(1)聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。(2)原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。

SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。(3)SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:聚丙烯酰胺凝胶电泳为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

凝胶色谱法与电泳法的比较内容凝胶色谱法电泳法分离依据分离动力分子大小的影响分子相对分子质量大小重力分子大，移动速度快分子带电性质差异、分子大小和形状等电场力分子大，阻力大，移动速度慢

酸和碱缓冲剂使用比例基础知识思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3

思考：在整个实验过程中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。

血液组成成分（1）洗涤红细胞（2）释放血红蛋白（3）分离血红蛋白（4）透析血红蛋白1、样品处理3、纯化4、纯度鉴定2、粗分离SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度凝胶色谱法进行纯化除去分子较小的杂质将分子量较大的杂质蛋白质除去。二、实验操作－－实验步骤血浆血细胞血小板白细胞红细胞水，蛋白质，无机盐，血液运输的物质血红蛋白

3g柠檬酸钠低速短时间离心红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液不再呈现黄色样品处理——1.红细胞的洗涤血液100mL67页防止血液凝固去除杂蛋白离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果

目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞吸水涨破溶解红细胞的细胞膜，能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。加速红细胞的破裂样品处理——2.血红蛋白的释放洗涤红细胞加蒸馏水至原血液体积加入40%体积的甲苯磁力搅拌器充分搅拌

滤纸过滤除去脂溶性沉淀层分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白样品处理——3.分离血红蛋白溶液将混合液离心→将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体。无色透明的甲苯层白色脂溶性物质沉淀层红色血红蛋白溶液暗红色其他杂质沉淀物分液漏斗

20mmol/L磷酸缓冲液1.透析的原理是什么？2.透析的目的是什么？1mL1mL1mLP67右下资料粗分离——透析血红蛋白透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。体现半透性

1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱纯化——凝胶色谱法

步骤操作要求①固定色谱柱色谱柱垂直固定在支架上②计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量③配制悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴④装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲动⑤缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h使凝胶装填紧密2.凝胶色谱柱的装填这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。69页操作提示2

2.凝胶色谱柱的装填注意事项操作提示70页：31.