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微生物限度检查方法验证方案

1.目的：

为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，涉及细菌、霉菌

及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较实验菌的恢复生

长结果，来评价整个检查方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在

该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法合用于该

品种的微生物限度检查。

验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊因素确需变更

时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准

2.范围：

本验证方案合用于微生物限度检查方法的验证。

3.规范性引用文献：

根据《中国药典》2023年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法的规

定，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发

生改变或原检查法的检查条件发生改变时，也许影响检查结果的准确性，必

须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实行：

4.4.1实验前的准备:

4.4.1.1实验用品的准备：将实验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、

滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎

好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30min，在3天内使用。

4.4.1.2实验用培养基的制备：取合用性检查合格的营养琼脂培养基、玫

瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂

培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制

说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，

灭菌15min，在3周内使用。

4.4.1.3实验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按

照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶

液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，

加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15min，在3周内使用。

4.4.2实验菌的制备和稀释：

4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：

4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物

少许接种至10ml营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的

新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，在23～28℃培养24～48小时；取黑曲

霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天。

4.4.2.1.2将上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠

菌的均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释制成每1ml含菌

50～100cfu的实验菌液。在黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养基中，加入3～5ml

含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱（菌悬

液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含

菌50～100cfu的实验孢子液。

4.4.2.1.3上述菌液在供实验的同时，取1ml注皿、培养、计数；大肠埃

希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂培养基，于30～35℃倒置培

养48小时，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，于23～28℃倒置培

养72小时。

4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液：

4.4.2.2.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假

单胞菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中，生孢梭菌的新鲜培养物少许

接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，在30～35℃培养18～24小时。

4.4.2.2.2取上述均匀培养物（菌悬液），用0.9%无菌氯化钠溶液对倍

稀释，制成每1ml含菌10～100cfu的实验菌液。

4.4.2.2.3上述菌液在供实验的同时，取1ml注皿、注入营养琼脂培养

基，于30～35℃倒置培养48小时，计数。

4.4.3供试液的制备：

4.4.3.1根据供试品的理化特性