利用CRISPR_Cas9系统构建Hvcn1基因敲除小鼠及其在黑碳暴露肺损伤中作用研究.pdf

摘要

目的：黑碳（Blackcarbon，BC）是大气细颗粒物（PM2.5）的关键成分，吸

附重金属后会因其理化性质发生改变而导致各种毒性效应和健康风险。当前，开

展BC的健康效应和毒理学研究是PM2.5健康效应研究中一个亟待解决的问题。

电压门控质子通道Hv1（Hvcn1基因编码）的主要作用是从细胞质中排出由

NADPH氧化酶（NOX）产生的质子，以维持呼吸爆发。研究表明Hv1在肺组织

中具有选择性和功能性的表达，但在BC暴露的肺损伤中的作用尚未报道。本研

究利用CRISPR/Cas9技术和显微注射技术获得Hvcn1基因敲除（KO）小鼠，并

通过羧化黑碳（c-BC）和羧化黑碳-铅复合物（c-BC-Pb）暴露野生型（WT）和

KO小鼠，研究Hvcn1基因在BC暴露导致小鼠肺损伤中的作用。

方法：利用CRISPR/Cas9技术和显微注射技术获得KO小鼠。通过测序和

普通PCR检测基因水平是否敲除；通过RT-PCR检测mRNA水平是否敲除；利

用Hv1特异性抗体通过免疫组织化学染色检测蛋白水平是否敲除。

选取8周龄WT和KOC57BL/6N雄鼠进行鼻腔滴注暴露，实验共分为6组：

ControlWT、ControlKO、c-BCWT、c-BCKO、c-BC-PbWT、c-BC-PbKO。采

用全自动生化分析仪检测肺泡灌洗液（BALF）中白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶

（ALP）和乳酸脱氢酶（LDH）含量；采用白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因

子-α（TNF-α）、白细胞介素-8（IL-8）和C反应蛋白（CRP）试剂盒检测BALF

中炎性细胞因子含量；采用ELISA试剂盒检测丙二醛（MDA）、超氧化物歧化

酶（SOD）和转化生长因子-β1（TGF-β1）含量；通过HE染色检测肺组织病理

变化；通过免疫组织化学染色检测上皮间质转化（EMT）标志物E-钙黏蛋白

（E-Cadherin）和波形蛋白（Vimentin），并用Image-ProPlus软件计算平均光密

度值（meanIntegratedOpticalDensity，meanIOD）以半定量两种蛋白在肺中的

表达量。

结果：基于四条sgRNA和Cas9蛋白混合注入C57BL/6N小鼠受精卵胞浆的

CRISPR/Cas9技术敲除效率为100%，最终成功构建2种KO小鼠（Mut1、Mut2）。

免疫组织化学染色结果表明KO小鼠肺组织中不表达Hv1蛋白阳性信号。小鼠

生殖能力分析实验表明两种KO小鼠自交后代雄鼠数量明显多于雌鼠。

I

WT和KO小鼠暴露两种BC后体重无差异。KO小鼠BALF中ALB、ALP

含量明显高于WT小鼠，LDH含量仅在c-BC-Pb暴露后明显高于WT小鼠。KO

小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量在c-BC-Pb暴露后明显高于WT小

鼠。KO小鼠BALF中SOD含量明显低于WT小鼠，MDA含量仅在c-BC暴露

后明显高于WT小鼠。KO小鼠BALF中TGF-β1含量明显高于WT小鼠。HE

染色结果表明c-BC暴露后KO小鼠表现出局部肺泡壁明显增厚并伴有炎细胞浸

润；c-BC-Pb暴露后KO小鼠肺泡内含纤维蛋白沉积物和大量炎细胞浸润。免疫

组织化学染色的半定量分析结果表明与c-BCWT相比，c-BCKO组E-Cadherin

meanIOD值明显降低，VimentinmeanIOD值明显升高；与c-BC-PbWT相比，

c-BC-PbKO组E-CadherinmeanIOD值明显降低，VimentinmeanIOD值明显升

高。

结论：本实验成功构建了两种Hvcn1基因敲除小鼠且敲除效率为100%。动

物实验结果表明Hvcn1基因敲除导致BALF中四种炎性细胞因子含量升高，三

种生化指标含量升高，以及肺组织氧化损伤，病理变化和EMT，即Hvcn1基因

敲除会加重两种BC暴露导致的小鼠肺损伤。

关键词：CRISPR/Cas9