生化技术凝胶过滤.ppt

一、基本原理凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度用表示洗脱体积；外水体积；凝胶床体积在一定层析条件下，和均为固定值，而随着被分离物分子量的变化而变化。组分分子量越大，则洗脱更容易（排阻越多），越小，越小第25页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三各组分间的值差异越大，分离效果越好；差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分第26页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三1、当Kav=0时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ）2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi（图中组分Ⅲ）第27页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三3、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+Kav（Vi＋Vg）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间变化（图中组分Ⅱ）4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用（从内水中洗脱出来的含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在SephadexG-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值第28页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三二、值的测定只要测出、和，即可计算出值的测定：（1）计算法：（2）测定法：第29页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三的测定：用蓝色的葡聚糖2000（M=200万），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（210、260或620nm）洗脱体积的测定：用、N-乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是（=1）当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则介于和之间（即=0~1）第30页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三第31页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三第三节操作第32页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三（一）凝胶的选择1.型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同如：SephadexG型多用于分离蛋白质；生物胶和Sephacryl等多用于分离核酸；要除去蛋白质中的盐类，多用SephadexG-252.粒度：粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空隙小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径的层析柱一、凝胶的选择与处理第33页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三第34页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三（二）凝胶用量计算由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝胶用量需增加10~20%第35页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三（三）凝胶的处理将所用的干胶置于5~10倍量的D.W中，充分浸泡（表6-2溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室温浸泡0.5h，抽滤除去碱液，用D.W洗至中性。再用抽气方法以D.W或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡第36页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三1．柱子的选择①当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高②柱长相同时，直径大者比小者分辨率高③床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高一般理想的层析柱直径与长度之比是1：25~1：100；层析柱外面最好有夹套，能控制温度（柱温箱），以保证结果的重复性2．装柱：常用湿装法（第三章）3．凝胶柱的鉴定二、凝胶柱的制备第37页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三流速、柱长对分离的影响第38页，讲稿共70页，2023年5月2日，星期三加样量与层析柱床体积及