探究抗生素对细菌的选择作用实验改进 论文.docx

探究抗生素对细菌的选择作用实验改进

摘要

为探索抗生素对细菌的选择作用的适宜抗生素浓度，增加了预实验，比较不同浓度的抗生素抑菌效果。改进原实验滤纸圆片法为打孔法获得的抑菌圈清晰均匀，误差小，实验操作简便；涂布平板法改进为预加菌液法获得的菌体生长均匀，效果明显，实验重复性高且效果好。

关键词

抗生素；抑菌圈；滤纸圆片法；打孔法；连续培养

引言

探究抗生素对细菌的选择作用是新教材人教版（2019版）必修二第六章第3节第一部分种群基因组成的变化中探究实验，在原教材中，本实验是作为课后练习题，新课标对本实验的要求是探讨细菌耐药性的出现与抗生素滥用的关系，解释现存生物适应性的原因。以此来提高科学探究能力，培养科学思维，落实生物学核心素养。

新教材中设置目的是通过探究实验方案的设计，并分析结果，学会运用进化与适应观，解释生物进化的普遍性，深切认识到滥用抗生素类药物的危害。其原理是一定浓度的抗生素会杀死细菌，但变异的细菌可能产生耐药性，如果连续培养，并在培养基中添加抗生素，耐药菌有可能存活下来。实验步骤方法是将含有抗生素的滤纸片放在接种过细菌的培养基上，经过一段时间恒温培养后，滤纸片周围就会出现抑菌圈，从抑菌圈的内侧边缘上挑取菌落，进行连续培养，以此重复几代，记录每一代培养物的抑菌圈直径，从而推导出细菌耐药性的变异及抗生素的选择作用。

笔者开展此实验后，发现使用原方法获得的抑菌圈形状不均匀，很难测量，误差较大，因此笔者从实验方法上进行了改进。

一、材料用具

大肠埃希氏菌ATCC25922（E.coli）、卡那氯霉素（Kan）、氨苄青霉素（Amp）、LB琼脂培养基、LB液体培养基、无菌水、移液器及移液器枪头、滤纸圆片、培养皿、接种环、涂布棒、酒精灯、质量分数为70%的酒精、烧杯、记号笔、直尺、镊子、EP管、打孔器、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、干热灭菌箱、震荡培养箱。

二、实验操作与过程

1制备菌液和抗生素

将购买的甘油菌种划线到平板培养基上，恒温（37℃）培养18-24h，挑取单菌落接种至100ml液体培养基中恒温摇床震荡培养16h，菌液冰箱保存备用。

Kan和Amp用无菌水配好（Kan40mg/ml，Amp100mg/ml）贮存备用。

2实验流程

（1）实验所用到的相关仪器和培养基进行高压蒸汽灭菌；

（2）倒平板并涂布平板法接种E.coli；

（3）做标记并将含有抗生素的滤纸片放在培养基上；

（4）恒温培养，37℃恒温培养箱连续培养18h；

（5）连续培养，记录每一代的抑菌圈直径；

（6）整理数据，分析结果。

3实验方法改进

（1）增加预实验

由于教材中并没有给出具体的抗生素和浓度，因此在开展实验前增加了尝试探究两种抗生素的使用浓度对E.coli的抑菌效果，分别对Kan和Amp进行了梯度浓度实验，比较不同浓度下的抑菌圈大小，继而选择后续开展实验所使用的适宜浓度。

（2）选用打孔法代替滤纸圆片法

教材中采用的是滤纸圆片法，但实际操作过程中易使滤纸片圆片上抗生素吸附的含量不同，从而造成抑菌圈大小不一，误差较大，且操作上较繁琐。笔者通过查阅资料将滤纸圆片法改为打孔法，即用灭过菌的打孔器在涂布过菌液的培养基上打一个小孔，用灭过菌的镊子挑取孔内的培养基，用移液器注入50μl的抗生素，冰箱预扩散1h后，再37℃恒温培养。

（3）预加菌液法代替涂布平板接种法

由于微生物培养要到选修课程才开展，学生对于微生物培养没有基础，因此在进行涂布平板法接种过程中，容易造成菌液涂布不均匀，引起菌体生长不够均匀，影响抑菌圈直径的测量。笔者通过查阅相关资料，采用预加菌液法代替涂布平板法，即直接把菌液加入到冷却至40-50℃的培养基中，摇匀后再倒平板，冷却凝固后采用打孔法加入抗生素。

三、实验结果与分析

1不同方法获得的抑菌圈比较

图1不同抑菌圈方法的比

从图1中可以看出，滤纸圆片法获得的抑菌圈大小不均匀，且平行重复实验在同一个平板上，容易造成抑菌圈交叉现象，影响测量，这是由于在蘸取抗生素过程中滤纸片上吸附的量很难控制，且重复性较差，不适宜定量实验，只适合定性实验。采用改进后的方法获得的抑菌圈均匀规则便于测量，且重复性高，方法上操作简便，同时为避免抑菌圈交叉采用多个平板进行平行重复实验。

2不同实验平板制备的比较

可以看出，采用预加菌液法获得的平板质量最高，菌体均匀生长；测量抑菌圈直径，打孔法误差最小，并且实验经过多次重复，误差小。分析实验过程中的操作细节，涂布滤纸片法和涂布打孔法获得的菌体生长不够均匀的原因可能是操作不熟练造成菌液涂布不均匀，从而不能很好的分布于平板各个角落，多次重复效果差；预加菌液法获得的平板质量最高，原因是在倒平板前将菌液加入培养基中摇匀后再倒，保证所有平板中菌液的浓度是一致的，从而使菌体均匀生长。因此后续实验可以采用预加菌液打孔法。

3抗生素最适浓度