荧光定量PCR原理介绍.pptx

荧光定量PCR原理介绍

汇报人：XX

2024-01-16

目录

contents

荧光定量PCR概述

荧光定量PCR基本原理

荧光定量PCR实验流程

荧光定量PCR数据分析方法

荧光定量PCR技术应用实例

荧光定量PCR技术挑战与展望

01

荧光定量PCR概述

荧光定量PCR（Real-timeFluorescentQuantitativePCR，简称RT-qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过荧光信号实时监测PCR产物量的技术。

自1992年Higuchi首次提出实时荧光定量PCR技术以来，该技术经历了不断完善和发展的过程，现已成为分子生物学研究中不可或缺的工具。

发展历程

定义

技术特点

荧光定量PCR技术利用荧光基团标记的特异性引物或探针，在PCR扩增过程中实时监测荧光信号的变化，从而实现对目标基因表达的定量分析。

优势

与传统的PCR技术相比，荧光定量PCR具有更高的灵敏度、特异性和准确性，能够实现对目标基因表达的精确定量分析，同时避免了传统PCR技术中可能出现的假阳性和假阴性结果。

02

荧光定量PCR基本原理

聚合酶链式反应（PCR）

PCR是一种分子生物学技术，通过特定的引物和DNA聚合酶，将特定的DNA片段在体外进行快速、特异的扩增。

PCR反应过程

PCR反应包括三个基本步骤，即退火、延伸和变性，通过循环这三个步骤，实现DNA片段的指数级扩增。

荧光染料是一种能够结合到DNA双链上并发出荧光的化学物质，如SYBRGreen等。当染料结合到DNA双链上时，其荧光信号会显著增强。

荧光染料

荧光探针是一种特异的寡核苷酸，其两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。当探针完整时，荧光基团和淬灭基团相互接近，荧光信号被淬灭。而在PCR扩增过程中，探针被特异性地切割，使得荧光基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号。

荧光探针

实时荧光检测系统

实时荧光检测系统能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号变化。通过检测荧光信号的强度和变化速率，可以对PCR产物进行定性和定量分析。

数据分析方法

数据分析方法包括标准曲线法、比较Ct法等。标准曲线法是通过构建已知浓度的标准品与Ct值之间的线性关系，对未知样品进行定量分析。比较Ct法则是通过比较待测样品与参照样品之间的Ct值差异，对待测样品进行相对定量分析。

03

荧光定量PCR实验流程

收集待测样品，如细胞、组织、血液等，并进行适当处理以获得高质量的DNA。

样品准备

使用合适的DNA提取方法，如酚氯仿法、试剂盒法等，从样品中提取出DNA。提取过程中应避免DNA降解和污染。

DNA提取

VS

根据目标DNA序列，设计特异性引物。引物长度通常在18-24bp之间，GC含量适中，避免引物自身互补和形成二级结构。同时，引物序列应避免与非目标序列产生非特异性扩增。

引物合成

将设计好的引物序列送至专业合成公司进行合成。合成后的引物需进行纯化和质量检测，以确保其质量和特异性。

引物设计

PCR反应体系配制

按照一定比例将DNA模板、引物、dNTPs、PCR缓冲液、荧光染料或荧光探针等组分混合，配制PCR反应体系。其中，荧光染料或荧光探针的选择应根据实验需求和目标DNA序列的特点进行。

PCR扩增

将配制好的PCR反应体系放入PCR仪中，设置合适的扩增程序（包括预变性、变性、退火和延伸等步骤）进行PCR扩增。在扩增过程中，荧光信号被实时监测并记录。

荧光信号分析

通过专业软件对收集到的荧光信号进行分析和处理，得到目标DNA序列的定量结果。常见的分析方法包括绝对定量和相对定量两种。绝对定量是通过与已知浓度的标准品进行比较来确定样品中目标DNA的浓度；相对定量则是通过比较不同样品间目标DNA与内参基因的表达量差异来评估基因表达水平的变化。

04

荧光定量PCR数据分析方法

通过构建已知浓度的标准品，建立荧光信号与DNA浓度的标准曲线，从而根据未知样品的荧光信号强度推算出其DNA浓度。

首先构建一系列已知浓度的标准品，并进行荧光定量PCR扩增。以标准品的浓度为横坐标，荧光信号强度为纵坐标，绘制标准曲线。然后根据未知样品的荧光信号强度，在标准曲线上找到对应的DNA浓度。

原理

步骤

原理

通过比较目标基因与内参基因（或对照基因）的荧光信号强度比值，来反映目标基因的相对表达量。这种方法可以消除实验过程中的误差，如RNA提取、反转录和PCR扩增等步骤的效率差异。

要点一

要点二

步骤

首先选择适当的内参基因，并进行荧光定量PCR扩增。然后分别计算目标基因和内参基因的荧光信号强度（Ct值），并计算两者的差值（ΔCt）。最后比较不同样品间ΔCt的差异，得出目标基因的相对表达量。

原理

通过构建已知浓度的目标基因标准品，建立荧光信号与DNA浓度的绝对定量标准曲线。然后根据未知样品的荧光信号强度，在标准曲线上