实时荧光定量PCR原理讲解.pptx

实时荧光定量PCR原理讲解汇报人：XX2024-01-16

CATALOGUE目录实时荧光定量PCR概述实时荧光定量PCR基本原理实时荧光定量PCR实验步骤数据分析与结果解读实时荧光定量PCR技术应用举例实验注意事项与常见问题解答

01实时荧光定量PCR概述

定义实时荧光定量PCR（Real-TimeQuantitativePCR，RT-qPCR）是一种在PCR扩增过程中实时监测荧光信号变化，从而实现对特定DNA序列进行定量的技术。发展历程自1990年代初期荧光定量PCR技术的出现，经过不断的技术改进和优化，实时荧光定量PCR已经成为分子生物学研究、医学诊断和生物技术领域的重要工具。定义与发展历程

在PCR扩增过程中实时监测荧光信号变化，无需后续处理。实时监测能够检测到极低浓度的DNA模板。高灵敏度技术特点与优势

高特异性：通过特异性引物和探针设计，实现对目标DNA序列的精确检测。技术特点与优势

03适用范围广可用于DNA、RNA等多种类型模板的定量检测，广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。01准确性高通过荧光信号的实时监测，避免了传统PCR方法中的终点检测误差。02重复性好实时荧光定量PCR实验操作简便，结果稳定可靠，重复性好。技术特点与优势

基因表达分析用于研究不同生理或病理状态下基因表达的差异。用于检测基因突变，如SNP、插入或缺失等。用于快速、准确地检测病原体，如病毒、细菌等。用于遗传性疾病的基因诊断和产前诊断。实时荧光定量PCR技术的出现极大地推动了分子生物学和相关领域的发展，为疾病诊断、治疗和预防提供了有力支持，同时也促进了生物技术产业的快速发展。突变检测遗传性疾病诊断意义病原体检测应用领域及意义

02实时荧光定量PCR基本原理

荧光共振能量转移是一种非辐射性的能量转移过程，发生在两个荧光分子之间，其中一个分子（供体）在激发状态下将能量转移给另一个分子（受体），使得受体分子发出荧光。FRET现象发生FRET的两个荧光分子需要满足一定的条件，包括供体和受体的荧光发射和吸收光谱重叠、两者之间的距离足够近（通常小于10nm）以及供体和受体的偶极矩相对取向合适。FRET条件荧光共振能量转移（FRET）

实时荧光定量PCR中常用的荧光探针包括TaqMan探针、分子信标探针和杂交探针等。这些探针在设计和合成时需要考虑到特异性、灵敏度和稳定性等因素。探针类型荧光探针通常由荧光基团、淬灭基团和连接两者的寡核苷酸链组成。荧光基团在激发状态下发出荧光，而淬灭基团则能够吸收荧光并使其淬灭。当探针与靶序列结合时，荧光基团和淬灭基团分离，荧光得以恢复。探针结构荧光探针设计与合成

扩增曲线在实时荧光定量PCR过程中，随着PCR反应的进行，荧光信号逐渐增强。通过实时监测荧光信号的变化，可以得到一条扩增曲线，该曲线反映了PCR产物的数量与循环数之间的关系。Ct值Ct值是指PCR扩增过程中荧光信号达到设定阈值时的循环数。Ct值与起始模板数量成反比，即起始模板数量越多，Ct值越小。因此，通过比较不同样本的Ct值，可以对样本中的目标基因进行定量分析。扩增过程中荧光信号变化

03实时荧光定量PCR实验步骤

收集待测生物样品，如细胞、组织或血液等，并进行适当处理以获得高质量的DNA。使用适当的DNA提取方法，如酚-氯仿抽提、试剂盒提取等，从样品中分离出DNA，并进行纯化和浓度测定。样品准备与DNA提取DNA提取样品准备

引物设计与合成引物设计根据目标基因序列，使用引物设计软件设计特异性引物对，引物长度通常在18-24个碱基之间，GC含量适中，避免引物二聚体和非特异性扩增。引物合成将设计好的引物序列送至专业合成公司进行合成，获得高纯度的引物。

按照荧光定量PCR试剂盒说明书配制反应液，包括DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液等。反应液配制加样封膜与离心将配制好的反应液分装到PCR管或96孔板中，每孔加入适量的DNA模板。使用封膜机对PCR管或96孔板进行封膜，然后进行短暂离心以确保反应液沉降至管底。030201扩增反应体系建立

VS根据荧光定量PCR仪的操作指南设置扩增程序，包括预变性、变性、退火和延伸等步骤的温度和时间参数。程序优化根据实验结果对扩增程序进行优化，如调整退火温度、延伸时间等，以获得最佳的扩增效率和特异性。同时，可以设置熔解曲线分析步骤以检测扩增产物的特异性。扩增程序设置扩增程序设置及优化

04数据分析与结果解读

荧光曲线类型及意义实时荧光定量PCR过程中，荧光信号随扩增循环数增加而逐渐增强的曲线。扩增曲线的形状和斜率可以反映PCR反应的效率和特异性。扩增曲线在PCR反应结束后，通过逐渐升温使DNA双链解离，同时监测荧光信号变化得到的曲线。溶解曲线可以用于检测PCR产物的特异性和是否存在引物二聚体等非特异性产物。溶解曲线