免疫细胞的分离技术.ppt

快速，方便纯度和得率均较低易引起Mo/M?激活，引起基因表达和分泌蛋白优点缺点*将特异性抗单核细胞表面分子CD14的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合，用这种免疫磁珠从PBMC中结合单核细胞在磁场中，结合单核细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱CD14+单核细胞免疫磁珠法阳性选择单核细胞*将多种特异性抗非单核细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非单核细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的单核细胞被洗脱下来免疫磁珠法阴性选择单核细胞*MonocyteIsolationKitIINon-monocytes,suchasTcells,NKcells,Bcells,dendriticcells,andbasophils,areindirectlymagneticallylabeledusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesagainstCD3,CD7,CD56,CD19,CD16,CD123,andCD235a(GlycophorinA),aswellasAnti-BiotinMicroBeads.Highlypureunlabeledmonocytesareobtainedbydepletionofthemagneticallylabeledcells.PBMCbeforeseparationUntouchedMonocytes免疫磁珠法阴性选择单核细胞*PBMC用PBS洗涤，低温离心弃上清加入含AB血清的PBS封闭，4℃孵育10分钟加入适量的FITC-CD14抗体，4℃孵育30分钟PBS洗涤，低温离心弃上清并用RPMI1640重悬流式细胞术分选流式细胞术分选单核细胞*（四）自然杀伤细胞（NK）的分离技术无须抗原预先作用，可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，在机体免疫监视和早期抗感染过程中起重要作用*NK细胞表面标志表面标志抗原：CD3-、CD56+、CD16+*NKcellIsolationKitNon-NKcells,i.e.,Tcells,Bcells,stemcells,dendriticcells,monocytes,granulocytes,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesandtheNKCellMicroBeadCocktail.IsolationofhighlypureNKcellsisachievedbydepletionofmagneticallylabeledcells.PBMCbeforeseparationUntouchedNKcells免疫磁珠法*三、免疫细胞分离的临床意义*免疫细胞的分化*肿瘤局部微环境内的抑制性细胞亚群调节性T细胞（regulatoryTcells,Treg）髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressorcells,MDSCs）肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,TAM）调节性NK细胞（regulatoryNKcells）调节性树突状细胞（regulatoryDC）*记忆T细胞(Tm)效应性记忆T细胞TEM外周炎症组织行使速发性效应功能CD45RO+CCR7-CD62L-中枢性记忆T细胞TCM外周淋巴器官分化成效应细胞CD45RO+CCR7+CD62L+***********玫瑰花结法（E花环沉降法）尼龙毛柱分离法淘洗法免疫磁珠法流式细胞术分选法（二）T淋巴细胞及其亚群的分离*人T淋巴细胞表面表达CD2分子，即绵羊红细胞受体，B细胞则无。在适当的条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结（rosette）,因为红细胞环绕T细胞，形似花环，所以又称E-花环（E-rosette）该实验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况玫瑰花结法*淋巴细胞+SRBC悬液→37°C水浴10min→