电压钳制和膜片钳制技术.ppt

一基本原理膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。第31页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三膜片钳技术原理示意图Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。第32页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三膜片钳与电压钳的区别膜电位钳制的方法不同；电位固定的细胞面积不同；研究的离子通道数目不同；第33页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三(1)测量部分：(2)串联电阻补偿部分：(3)电容补偿部分：(4)指令信号控制部分：(5)电源部分：膜片钳放大器主要组成:电极电流监视器、灵敏度开关、滤波器开关、方式选择开关。用于校正全细胞记录时，由于电极和细胞内之间的通路电阻所造成的膜电位误差。用来补偿电压突然改变时引起的电容电流。将一定的电压加入到刺激信号中，形成一指令信号的保持电压。进行电压钳制时，它决定膜电位值，作电流钳制时，则决定电流值。提供放大器各部分的电源。第34页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三贴附式全细胞记录模式负压吸内面向外式外面向外式拉细胞细胞细胞细胞拉并暴露于空气中四种经典记录模式(Cell-attachedorOncellmode)第35页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三第36页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三细胞贴附式膜片（cell-attachedpatch）优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。缺点：不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。于细胞牢固贴附于微管电极的尖由端而得名。它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。第37页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三贴附式记录（Cell-attachedrecording）细胞电极细胞膜胞外液胞内液第38页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三内面向外式膜片(inside-outpatch)细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。应用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使直接作用于膜内，引起通道开闭。第39页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三内面向外记录（Inside-outrecording）电极脂质双分子层的内面面向浴液第40页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三外面向外式膜片(outsideoutpatch)细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。优点：缺点：应用：可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。第41页，讲稿共77页，2023年5月2日，星期三外面向外记录（Outside-outreco