广西《水牛体细胞核移植技术操作规程》.docVIP

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FORMTEXT广西壮族自治区地方标准

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FORMTEXT水牛体细胞核移植技术操作规程

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FORMTEXT（本稿完成日期：）

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水牛体细胞核移植技术操作规程

范围

本标准规定了水牛体细胞核移植的术语和定义、试剂与仪器设备、体细胞核移植、核移植胚胎、胚胎发育特征与分级等技术要求。

本标准适用于水牛体细胞核移植胚胎生产的规范化操作。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

体外成熟in-vitromaturation

不经超数排卵或应用少量促性腺激素处理后，从活体或离体卵巢上获取未经体内成熟的卵母细胞，经过适宜的条件进行体外成熟培养，使卵母细胞恢复减数分裂到减数第2次分裂中期(MII期)并具备受精能力的发育过程。

3.2

体细胞核移植somaticcellnucleartransfer

将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。

试剂、耗材、设备和实验室要求

试剂

所用试剂、药品以及要求见附录A。

耗材

所用耗材见附录A。

设备

所用主要设备见附录A。

实验室要求

工作区由准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室等组成。其中，缓冲间面积不得小于3m2，要求安置更衣柜和紫外灯，紫外灯强度不得低于1.5W/m3。紫外灯管距地面距离不应超过2.5m，实验操作前每次照射时间为20min～30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级，操作区应达到百级。

体细胞核移植的供体受体准备

卵母细胞的来源与收集

母水牛屠宰后30min内从屠宰场采集卵巢，置于30℃～37℃、含适量抗生素（如：100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)中，3h内送至实验室。

在无菌条件下用37℃左右、含适量抗生素的生理盐水或PBS洗涤卵巢，去除周围结缔组织后，用纱布吸干卵巢表面水分，用注射器套16号针头抽吸卵巢表面直径2mm～8mm的可见卵泡，回收卵泡液及其内容物。

将卵泡液转入?35mm或?60mm的一次性塑料培养皿中，用自制的玻璃吸胚管或20μL加样枪套吸头，在体视显微镜下收集卵丘－卵母细胞复合体（Cumulus-oocytecompLexes,COCs，以下简称COCs），并转入盛有新鲜洗卵液的培养皿中。

卵母细胞的分级选择

卵母细胞分为A、B、C和D四级，其分级标准如下：

——A级：胞质均匀，外周包裹有三层以上致密卵丘细胞的卵母细胞；

B级：胞质均匀，外周包裹卵丘细胞低于三层或部分脱落的卵母细胞；

C级：卵丘细胞成蛛网状扩散或全部脱落、或胞质不均匀的卵母细胞；

D级：不规则、过成熟、死亡或退化的卵母细胞。

注：一般选用A、B级卵母细胞用于培养；C、D级卵母细胞放弃不用。

核移植胚胎的生产

5.3卵母细胞体外成熟培养

收集到的COCs用成熟培养液（见附录B）洗涤3次后，转入提前预热2h、含1mL成熟培养液的?20mm玻璃培养皿中。每个培养皿中放入的COCs不超过100个，并尽量集中在一起（亦可用50μL成熟培养液微滴覆盖石蜡油培养，每个微滴放入约10个COCs）。在39℃、5%CO2、完全相对湿度、提前湿热平衡24h以上的CO2培养箱中静置培养22h～24h。

5.4卵母细胞成熟的判定

COCs培养22h～24h后，在体视显微镜下观察，卵丘细胞扩散，卵胞质均匀、没有空泡，在0.1%透明质酸酶中吹打去除外周卵丘细胞后，轻轻翻转卵母细胞可以观察到第一极体（Pb1）则判定为成熟，否则视为未成熟。

5.5供体细胞的准备

5.5.1卵丘细胞的培养