广西《甘蔗感染黑穗病的鉴定方法 PCR 法》.docVIP

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FORMTEXT广西壮族自治区地方标准

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FORMTEXT甘蔗感染黑穗病的鉴定方法PCR法

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FORMTEXT（本稿完成日期：）

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FORMTEXT广西壮族自治区市场监督管理局发布

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甘蔗感染黑穗病的鉴定方法PCR法

范围

本标准规定了甘蔗黑穗病菌的PCR快速检测方法。

本方法适用于甘蔗组培苗、苗圃种苗及大田植株黑穗病菌的测定。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

术语和定义

甘蔗黑穗病原菌

甘蔗黑穗病病原菌为担子菌亚门孢堆黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌（Sporisoriumscitamineum）。

方法原理

应用聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）检测技术对甘蔗黑穗病原菌DNA进行体外扩增，可得到快速、有效的鉴定结果。

仪器

高速冷冻离心机、水浴锅、PCR仪、水平电泳装置、凝胶成像系统。

试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯（含）以上试剂或生化试剂，实验室用水应符合GB/T6682。所用试剂：十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、Tris、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、氯化钠、氯仿、无水乙醇、TE溶液、琼脂糖、硼酸、DNA相对分子质量标记、CTAB缓冲液（CATB4g，NaCl16.38g，Tris1.21g，EDTA1.49g，先用70mlddH2O溶解，再定容至200ml灭菌）、5×TBE溶液（Tris5.4g，EDTA0.372g,硼酸2.75g，先用70mlddH2O溶解，再定容至100ml灭菌）。

引物

正向引物bE4：5’-CGCTCTGGTTCATCAACG-3’，反向引物bE8：5’-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3’，预期扩增片段大小为420bp。

操作步骤

取100mg样品于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，装入2ml离心管中，加入750μLCTAB于样品管中，65℃水浴45min，隔15min轻微颠倒混匀，加500μL氯仿，颠倒混匀，12000r/min，离心3min，吸上清500μL到新的离心管中，加等量冰冻过的无水乙醇，在冰箱冷冻8min，12000r/min，离心3min，倒掉上清，放在纸上晾干，加超纯水溶解。

PCR扩增反应

PCR反应体系

PCR反应体系见表1。

PCR反应体系

试剂

体积

水

1?μL

2×EsTaqMasterMix

5?μL

10?μM正向引物

1.0?μL

10?μM反向引物

1.0?μL

DNA模板

2.0?μL

总体积

10.0?μL

PCR扩增程序

预变性94℃，4min；35次循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；延伸反应72℃，10min。

扩增产物的电泳检测

将适量的琼脂糖加入0.5×TBE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1％的溶液，然后按每100ml琼脂糖溶液中加入5μlGel-Red核酸染料的比例，混匀，稍适冷却后，将其倒在电泳板上，室温下凝固成凝胶后，放入0.5×TBE缓冲液中。在每个泳道中加入2.5μl的PCR产物（需和上样缓冲液混合），其中一个泳道加入DNA分子量标记，接通电源进行电泳。

凝胶成像分析

电泳结束后，将琼脂糖凝胶电泳置于凝胶成像系统成像仪上或紫外透射仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，并将电泳结果用照相系统拍照，根据有无特异扩增带（420bp）检测样品有无甘蔗黑穗病菌。

试验成立的条件

以水为空白对照，以感染甘蔗黑穗病的病株为阳性对照，以甘蔗无病种苗基因组DNA为阴性对照。

阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测均没有预期大小的目的条带。阴、阳性对照