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ICSFORMTEXT65.020.20
FORMTEXTB05
FORMTEXT?????
DBFORMTEXT45
FORMTEXT广西壮族自治区地方标准
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FORMTEXT?????
FORMTEXTSSR分子标记鉴定甘蔗品种真伪技术方法
FORMTEXTMethodofSSRMolecularMarkersinAuthenticityIdentificationofSugarcaneVarieties?????
FORMTEXT点击此处添加与国际标准一致性程度的标识
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FORMTEXT（本稿完成日期：）
FORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××发布
FORMTEXT××××-FORMTEXT××-FORMTEXT××实施
FORMTEXT广西壮族自治区市场监督管理局发布
DB45/T××××—××××
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SSR分子标记鉴定甘蔗品种真伪技术方法
范围
本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats.SSR）标记进行甘蔗（Saccharumofficinarum）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。
本标准适用于甘蔗品种的SSR指纹数据采集及品种鉴定。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
术语和定义
推荐引物recommendedprimer
品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。
原理
由于不同甘蔗品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异。这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同品种。
仪器
高速冷冻离心机、水浴锅、PCR仪、毛细管电泳仪、凝胶成像系统。
试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T6682。所用试剂：氯仿、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、4种脱氧核糖核苷酸、TaqDNA聚合酶、DNA分子量标准（DNA片段分布范围至少在50bp~500bp，该范围内DNA片段之间大小最小差异不高于100bp）、无水乙醇、CTAB提取溶液（5.00gCATB，16.38gNaCl，1.21gTris，1.49gEDTA，用适量水溶解后，调节pH，定容至200ml，高压灭菌）、DNA分析仪用丙烯酰胺胶液、DNA分析仪用分子量内标LIZ500、DNA分析仪用光谱校准基质（包括FAM、NED、VIC和PET4种DNA片段）、DNA分析仪用电泳缓冲液。
SSR引物
引物序列见附录A
操作步骤
DNA的提取
将待检甘蔗叶片剪碎，放入研钵中，加入液氮研磨成粉末状，取100mg放入1.5ml离心管中，加入750μlCTAB提取溶液，涡旋振荡混匀后于65℃温育45min，期间颠倒混匀离心管2次~3次，加人500μl的氯仿，颠倒混匀，12000r/min，离心3min，转移上清液至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的无水乙醇，于-20℃下静置8min，12000r/min，离心3min，小心弃去上清液，室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。加50μl超纯水，4℃保存备用。
注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本标准。
PCR扩增
反应体系
PCR反应体系见表1。
PCR反应体系
试剂
体积
水
22ｕl
2×EsTaqMasterMix
25ｕl
10μM正向引物
1.0ｕl
10μM反向引物
1.0ｕl
25mg/LDNA模板
1.0ｕl
总体积
50.0ｕl
反应程序
94℃预变性2min；35个循环：94℃变性30s，退火30s（退火温度见引物表），72℃延伸30s；最后72℃下延伸2min。
扩增产物检测
毛细管电泳检测
PCR产物样品准备
分别取等体积的稀释后的不同标记扩增产物溶液混合，从混合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用96孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，迅速置于冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上。
电泳检测
按照仪器操作手册，编辑
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