人类细胞质的提取.ppt

关于人类细胞质的提取第1页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三人类细胞质RNA提取第2页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三真核细胞质总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。第3页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三分离提纯RNA的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物第4页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三RNA的不稳定性由于核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活。所以需要RNA酶抑制剂来抑制RNA酶的活性。第5页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三3、分离高质量RNARNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。（1）常用的RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。第6页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。第7页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三（2）RNA提取的一般步骤RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA第8页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三?破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织加入β-ME可以抑制RNA酶活性?分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。?沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或异丙醇。第9页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三④洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。⑤融解RNA一般使用TE。⑥保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存也应该如此。第10页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三由于RNA的种类来源很多，因而提取制备方法各异。本次介绍的是Trizol法制备RNA。第11页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三Trizol法提取RNATRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。第12页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三Trizol试剂主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇以沉淀的方式还原。在除去水样层后，乙醇能沉淀析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。第13页，讲稿共29页，2023年5月2日，星期三【试剂】DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，异丙醇，无水乙醇，0.05～0.1％DEPC－H2O，75％乙醇，TE缓冲液，琼脂糖。【配制】1.DEPC水：1ml＋1000ml双蒸水＝1‰DEPC水，1000ml容量瓶