蛋白质测序分离及提纯.ppt

有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所得的最低相对分子质量是35200。用其他方法测得的Mr是69000，所以每分子牛血清清蛋白含有两个色氨酸残基。第29页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三2.7.2蛋白质纯化总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶第30页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三（一）利用溶解度差别的分离方法1.等电点沉淀和pH控制当蛋白质处于等电点pH值，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有斥力而趋向于凝聚而沉淀。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的理可以把蛋白质混合物分离开来。蛋白质混合物的分离纯化方法第31页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三2.蛋白质的盐溶和盐析中性盐对蛋白质有明显的溶解度影响。在低浓度时，中性盐增加蛋白质的溶解度，这种现象称盐溶。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。盐析：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。第32页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三3.有机溶剂分级法有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。第33页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三（二）根据分子大小不同的分离方法1.过滤与膜分离借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。第34页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三2.离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。第35页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104r/min，相对离心力达到1×104～1×105g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。超速离心机的最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力可以高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。第36页，讲稿共53页，2023年5月2日，星期三3.凝胶过滤层析（gel-filtrationchromatography）凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层