3.2细胞及其组分的分析方法.ppt

翟中和王喜忠丁明孝主编细胞生物学（第4版）Copyright?高等教育出版社2011第二节细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开一、用超离心技术分离细胞组分密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带二、细胞成分的细胞化学显示方法显色剂与细胞组分中特殊基团的结合通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量福尔根反应Feulgenstain特异显示细胞内呈紫红色的DNA的分布原理：酸水解可以去除RNA，仅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫试剂（Schiff’sreagent）反应呈紫红色三、特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异蛋白的显示可通过抗原－抗体特异结合的方法得以实现若抗体偶联荧光染料，则可以通过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察（一）免疫荧光技术直接免疫荧光技术（A）间接免疫荧光技术（B）（二）免疫电镜技术在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位免疫胶体金技术受到越来越多的青睐四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置原位杂交技术insituhybridization光镜水平同位素标记、荧光素标记或生物素标记的探针电镜水平生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合FISH(FluorescentInSituHybridization)

荧光原位杂交技术五、定量细胞化学分析与细胞分选技术流式细胞术flowcytometryFlowcytometricanalysisofSAOS-2cellsfollowinginductionofPUMA-?expressionfortheindicatedtimesNakanoetal.Molecularcell,2001,7:683-694本课程所用的一些素材为主讲教师多年的教学积累，来源于多种媒体，难以一一标明出处，特此说明并表示感谢！离心力和离心转速的换算是经常用到的，具体的计算公式如下：??RCF=1.118×10-5×N2×R??RCF表示相对离心力，单位为g??N表示转速，单位为rpm转/分??R表示离心半径，单位为cm。??离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ˉ，r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r，cm)。它们的关系是：F＝ˉ2R??为方便起见，F常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g(约等于9.8m/s2)得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。例如离心机转头平均半径是6cm，当转速是60000r/min时，离心力是240000×g，表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。??因此，转速r/min和离心力g值之间并不是成正比关系，还和半径有关。同样的转速，半径大一倍，离心力(g值)也大一倍。转速(r/min)和离心力(g值)之间的关系可用下式换算：??其换算公式如下：Mt\lS_x~RV????G＝1.11＊10（－５）＊R＊（rpm）２??G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示。10（－５）即：10的负五次方。（rpm）２即：转速的平方。??R为半径，单位为厘米。??例如，离心半径为10厘米，转速为8000，??其离心力为：????G＝1.11＊10（－５）＊10＊（8000）２＝7104??即离心力为7104g.而当离心力为8000g时，其转速应为：8489即约为8500rpm.值得注意的是，这里跟半径是相关的。也就是说，不同的离心机其换算关系是不一样的。??普通离心机可以用计算器算一下，很准。而低温离心机则不须如此费事。上面有按钮可以在rpm与g之间切换，非常方便。??以前的文章，尤其是国内的文章通常以rpm来表示。现在多倾向于以g来表示。??转速有离心力（×g）和每分钟转速（rpm)两种表示方式，有些离心机没有自动切换功能。下面的公式可以帮助解决这个问题：??g=r×11.18×10-6×rpm2(式中r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心管桶底的长度