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实验1 DNA提取纯化检

实验目的通过实验学习从血液中制备染色体DNA的方 法。学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、DNA的构型、含量以及分子量的大小。掌握DNA样品的纯化和定量检测方法。

红细胞裂解液裂解红细胞细胞裂解液裂解白细胞用蛋白酶K水解蛋白质有机溶剂酚、氯仿抽提在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分即可获得染色体DNA实验原理

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。实验原理

?纯净的DNAA260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8纯净的RNAA260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0如果制备的DNA样品A260/A2801.7，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；A260/A2802，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA；如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。实验原理

实验材料红细胞裂解液KHCO3 1gNH4Cl 8.3gEDTA·Na2 37mg(10mM)(155mM)(0.1mM)裂解缓冲液（lysisbuffer）(pH8.0)(pH8.0)Tris-ClEDTASDS10mM0.1M0.5%(m/v)ACD抗凝液柠檬酸柠檬酸钠右旋葡萄糖0.48g1.32g1.47g加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1mlACD液组织细胞动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0℃下保存数天或-70℃下长期冻存，备用。

酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）70%乙醇琼脂糖TAE电泳缓冲液电泳设备紫外分光光度计凝胶成像系统实验材料

染色体DNA的制备方法取800μl抗凝血液置于5ml离心管中。往管中加3ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上5分钟，期间间歇摇动几次。4000rpm，室温离心5分钟，弃上清。往管中加入3ml红细胞裂解液，重悬沉淀，冰上5分钟，期间摇几次。4000rpm，离心5分钟，弃上清。重复步骤4、5四至五遍，至出现明显白色沉淀。用1×PBS重悬白色沉淀。4000rpm，离心5分钟，弃上清。每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液（每小组配制1ml)，重悬细胞，加入20μlproteinaseK（20mg/ml），混匀后转移至1.5ml离心管，置55℃水浴1小时。

加入酚：氯仿500μl，盖紧后上下颠倒几次10000rpm，离心5分钟，取上层水相，至1.5ml离心管，加入氯仿500μl，盖紧后上下颠倒几次10000rpm，离心5分钟，取上层水相至5ml离心管。（两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm)加入1ml无水乙醇,可见混浊，盖紧后上下颠倒混匀可见DNA凝集成絮状，溶液又变澄清。12000rpm，离心2分钟，弃上清。用1ml70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm，离心2分钟，弃上清。开盖室温干燥沉淀2分钟。加入50μlDDW（无菌水）55℃水浴5分钟溶解DNA,取10μl电泳。加入3mlDDW至剩余样品中，室温混合2分钟，测OD260和0D280，计算DNA浓度及OD260/0D280。染色体DNA的制备方法

3.EB染色：EB是核酸的显色剂，使用EB对DNA染色的3种方法：在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。只在胶中加入EB，在电泳缓冲液中不加。这样可减少操作时双手受EB污染的可能。在电泳结束后，取出凝胶，放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30分钟。溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有50%蔗糖，可增加上样DNA溶液的密度，以确保DNA样品沉入点样孔内，起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300~400bp双链线状DNA。点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。EB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时