基因的分离与鉴定.ppt

显色筛选法的基本操作将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落第55页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三2.根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表现出外源基因编码的表型特征。第56页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三Example:λgt.λB噬菌体（由于C片断的缺失而造成重组缺陷的λred－噬菌体），在大肠杆菌ligts菌株上生长不能形成噬菌斑，在有连接酶功能的大肠杆菌lig＋菌株上形成噬菌斑。将具有连接酶基因的重组体噬菌体λgt.λB，涂布在大肠杆菌ligts菌株上时，通过寄主细胞的互补作用，能够形成噬菌斑。根据形成噬菌斑这种表型特征，直接选择具野生功能的重组体噬菌体。第57页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三缺点：不单要求克隆的DNA片断必须大到括足以包含一个完整的基因，而且还要求所编码的基因能够在大肠杆菌中实现功能表达。（对于真核基因很难达到要求）第58页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三物理检测法1.凝胶电泳检测法利用凝胶电泳的方法，鉴定外源片断是否插入及其长度优点：简便、快速缺点：只能提供克隆片段大小的信息第59页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三第23页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3’-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约20000条条带，基本涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA。5’-随机引物第24页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三由于在cDNA群体中，代表特定细胞类型或发育阶段的mRNA的含量非常低，所以要把一种只在某一阶段或某种细胞类型中表达、而在另一发育阶段或某种细胞类型中不表达的目的基因分离出来，就需要PCR扩增。DDRT-PCR第25页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三1.从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）的细胞群体中分离总mRNA，并用3’-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA;2.用5’-端随机引物和3’-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离基本过程：第26页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断；5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增；6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序；7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。第27页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三第28页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三1.可以同时比较多个样品表达的差异；2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因；3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来；4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。优点：第29页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三1.假阳性比例高（50%～75%）；同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差；mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探针2.扩增的差别条带分子长度比较短小（110～450bp）；局限性：第30页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三应用表达文库分离克隆的目的基因第31页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三当没有可用的核苷酸序列供作筛选基因文库的探针时，将cDNA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌寄主细胞然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克隆的真核目的基因。表达文库分离克隆的目的基因第32页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三1.表达的蛋白质以融合蛋白质的形式存在，其中原核蛋白质的氨基酸序列是整合在真核蛋白质的一个末端，不易被原核细胞中