酶的固定化 课件.ppt

实验木瓜蛋白酶的固定化酶活力测定：（1）溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37℃下预热10min，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位(U)(以下同)。第31页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三实验木瓜蛋白酶的固定化酶活力测定：（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。第32页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三实验木瓜蛋白酶的固定化结果计算：固定化酶总活力活力回收=————————×100%???????????溶液酶总活力??????????固定化酶总活力数相对活力=?——————————————?×100%???????溶液酶总活力数-残留酶活力数第33页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三3.固定化酶的性质（1）固定化后酶活力的变化——酶活力降低，反应速度下降原因：1）构象改变：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸。2）空间位阻：固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用。3）内扩散作用：内扩散阻力使底物分子于活性中心的接近受阻。4）立体障碍：包埋时酶被高分子物质包埋，大分子不能透过膜与酶接近。第34页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三（2）固定化酶的稳定性——大多提高1）稳定性大多提高热稳定性大多提高，有些反而下降对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高对不同pH（酸度）稳定性，对分解酶的稳定性、贮存稳定性和操作稳定性提高。2）稳定性提高的原因固定化后，酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形；酶活力的缓慢释放；抑制自降解，提高了酶稳定性。青霉素酰化酶：固定化酶在pH5.5~10.3稳定，游离酶仅在pH7.0~9.0稳定。第35页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三（3）固定化酶的最适温度变化——可能提高固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能变化也不大，有些会发生变化；由于固定化，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高；固定化酶的最适作用温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响。第36页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三（4）固定化酶的最适pH——发生改变酶经固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移；2）载体性质对最适pH的影响；一般用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH↑。一般用带正电荷载体（阳离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH↓。1）pH对酶活性的影响：改变酶的空间构象影响酶的催化基团的解离影响酶的结合基团的解离改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。第37页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三3）产物性质对最适pH的影响；产物酸性，其最适pH↑。产物碱性，其最适pH↓。产物中性，其最适pH不变。第38页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三（5）底物特异性——发生改变对作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化；对于可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。第39页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三（6）固定化酶的米氏常数（Km）——发生改变当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制，造成表观Km↑；由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。当载体与底物电荷相反，固定化酶的表观Km↓；当载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km显著增加。Km值又受载体的疏水性及溶液中离子强度的影响。第40页，讲稿共85页，2023年5月2日，星期三——改变——可能改变——发生变化固定化酶的性质固定化酶活力固定化酶的稳定性固定化酶的最适温度固定化酶的最适pH固定化酶的底物特异性固定化酶的米氏常数（Km）——活力降低——大多提高——可能提高载体性质带负