一、研究动机总结.docx

一﹑研究動機

六-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)為兒茶酚胺(catecholamine)神經元的專一性神經毒素，長久以來被使用做為產生巴金森氏症動物模式。然而，其如何造成動物中腦黑質神經元退化的機制，雖然經過了多年的探討，但到目前為止尚未完全清楚。近年來有些學者認為神經毒素能誘發細胞凋亡(apoptosis)，是與立即早期反應基因c-fos及/或與神經性一氧化氮(NO)關係非常密切。本研究於是選擇了能破壞多巴胺神經元，造成動物產生類巴金森氏症之藥物

OHDA，來探討大白鼠中腦黑質細胞退化及紋狀體可塑性的可能機制。

二﹑研究目的

（一）運用立體定位及免疫組織化學和組織化學技術，研究6-OHDA對紋狀體及黑質區多巴胺造成的傷害及其可塑性，與c-fos及NO是否相關。

（二）進一步研究神經毒素產生毒害黑質細胞造成細胞凋亡及紋狀體可塑性的分子機制。

（三）找尋預防神經退化及神經細胞死亡的藥物或其它可行辦法。

三﹑研究設備器材

（一）實驗器材

大白鼠（Sprague-Dawley）體重200至250公克(國家實驗動物中心，台北市南港)

電動剃毛刀、電動鑽

立體定位儀(David-Koff,USA)

手術器材︰手術刀、鑷子、探針（以濃度百分之七十酒精浸泡消毒）、棉棒、消毒紗布、外科手術釘、外科手術剪

微量注射器、微量吸管

動物旋轉儀

冷凍切片機（Reichert-Jung2880,Germany）8.蓋玻片、載玻片、滴管、玻璃管、毛筆

9.光學顯微鏡及攝影設備(Optiphot-II,Nikon,Japan)

（二）實驗藥品

麻醉藥（chloralhydrate）

神經毒素（6-hydroxyldopamine,6-OHDA）

生理食鹽水（normalsaline）

甲基安非他命

4﹪福馬林固定液

30﹪蔗糖溶液

包埋劑（O.C.T）

0.1M 磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液（phosphate buffersaline.PBS）

30﹪山羊血清（normalgoatserum）10.0.04%tritonX-100

11.酪胺酸水解酵素(tyrosinehydroxylase,TH)12.c-fos

reduced nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

(NADPH,Sigma,St.Louis,MO.,USA)

NitroBlueTetrazolium(NBT,Sigma,St.Louis,MO.,USA)15.次級抗體（biotinylatedgoatanti-rabbitIgG,VectorLab.,CA,

USA）

16.明膠（gelatin）

17.0.5﹪甲基綠（methylgreen）18.二甲苯（Xylene）

19.70%、95﹪、100﹪酒精

封片膠（Permount,FisherCo.,PA.,USA）

avidin-biotin-peroxidase complex ABC (Vector LabUSA)

, CA,

四﹑研究過程及方式

（一）實驗動物

大白鼠(Sprague-Dawley)體重200至250公克，飼養於室溫之動物室中。

（二）動物手術

實驗動物於手術前停止餵食物及水2小時，先將動物秤重並計算所需麻醉藥量(400毫克/100公克)，由腹腔注入麻醉藥後，將大白鼠放入籠內約5~10分鐘;待其深度麻醉後，即可用剃刀將其頭部上方的毛剃除。將老鼠置放於立體定位儀,首先以耳棒穿入外耳道，並將上下頷分開以固定夾將頭部水平固定。以優碘消毒其頭部後，再以70

％酒精清洗乾淨，以手術刀劃開頭皮,並將皮下組織及肌肉清除，以十字縫為參考點，將針尖在十字縫的位置向右移動1.2毫米，並向後移動4.5毫米，其下便為內側前腦束上方（medialforebrainbundle,MFB）之所在,即為入針的位置。以電鑽接上小鑽頭將頭骨鑽開。需以探針看是否已將頭骨鑽開;否則易鑽破硬腦膜及腦組織。將微量注射器以硬腦膜為參考點向下插至7.8毫米的MFB處，以每分鐘1微升的速度注入4微升可破壞兒茶酚胺的神經毒素6-OHDA，注射完後等5分鐘，才將注射器向上旋出，以減輕腦內壓力過大將所注入毒物壓擠出。注射後，將動物頭皮縫合，並打上耳號，擦上優碘即完成手術步驟。對照組微量注射器內的藥品改以溶解藥物含0.02％維他命C磷酸鹽緩衝液代替。

（三）測試動物注入6-OHDA後的運動行為反應

手術後的大白鼠送回動物室飼養3天及2週後，測試手術是否成功。由老鼠