动物细胞融合与杂交.ppt

第31页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞（一）、亲本细胞概述脾脏与B淋巴细胞(Blymphocytes)：一般来讲，脾脏有三大功能：1.它是“血库”，当人体休息安静时，它贮存血液；当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量。2.脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉。3.脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。第32页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三B淋巴细胞发育过程：祖B淋巴细胞前B淋巴细胞成熟B淋巴细胞抗原刺激、递呈细胞和Th细胞作用活化B淋巴细胞分化为浆细胞第33页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三骨髓瘤细胞(myelomacells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。①能在体外连续生长，倍增期短于24小时；②缺乏HGPRT酶；③克隆效应高；④在动物中有致肿瘤性；⑤与小鼠淋巴细胞融合率相当高；⑥本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。骨髓瘤细胞的选择原则第34页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三（二）、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体第35页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三免疫动物的选择选择免疫动物，即供脾动物，通常选用小鼠。正常供体和骨髓瘤细胞种系发生越近缘，产生的杂交瘤就越稳定(反之亦然)。因为作为融合用的大多数小鼠骨髓瘤细胞是从BALB/C纯系小白鼠取得，所以用BALB/C作脾细胞供体最为合适。第36页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：“稳妥；优势克隆”皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：“省时；省抗原”“省时”“操作繁琐”第37页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三免疫方案a.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5mlip↓3周后加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5mlip或iv(静脉内注射)↓取脾融合第38页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三b.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂;初次免疫Ag1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合第39页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三（2）、细胞融合及HAT筛选1、细胞融合方法：1)脾细胞悬液的制备：最后一次加强免疫后第3天制备（机械分离法），培养基RPMI1640。2)骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期挑选形态较好的细胞，台盼兰染色后计数，挑选80％以上存活率的细胞离心后重新悬浮。2)50%PEG配制：称取2gPEG（1000或4000）于青霉素瓶加塞，8磅（0.06MPa）15min，待冷至50℃加等量预热的不含血清的培养基。第40页，讲稿共66页，2023年5月2日，星期三1）108小鼠脾细胞与107骨髓瘤细胞混合，离心（1000rpm，10min），弃上清。2）轻扣管底，混匀细胞，37℃水浴3）60s内滴加0.6ml50％PEG，边滴边摇动试管，30s内将细胞悬液吸入吸管静置30s，再在30s内缓慢转入离心管；5min内后加入10mlDMEM终止PEG作用。3）离心，弃上清，加15mLHAT培养基，混匀，转入96孔板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100ul。