DB63T 1159-2012甘蓝型杂交油菜品种纯度检验 ISSR操作规程.docx

ICS65.020.20

B33

备案号：35826-2013

青海省

地

DB63

方标准

DB63/T1159—2012

甘蓝型杂交油菜品种纯度检验ISSR操作规程

2012-12-04发布

2013-01-01实施

青海省质量技术监督局发布

I

DB63/T1159—2012

前言

本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。

本规程起草单位:中国科学院西北高原生物研究所、青海省种子管理站。

本规程主要起草人：李毅、胡延萍、宋晓荭、彭秉玉、王莉、王焕强、巩爱岐、包天忠、王溪、冯

承彬。

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DB63/T1159—2012

甘蓝型杂交油菜品种纯度检验ISSR操作规程

1范围

本规程规定了甘蓝型杂交油菜(BrassicanapusL.和BrassicacampestrisL.)品种纯度ISSR指纹鉴定的术语和定义、设备与耗材、试剂及溶液的配制、操作程序、判定原则及报告等技术内容。

本规程适用于各级科研、推广、生产单位和种子部门等在甘蓝型杂交油菜品种纯度检验时使用。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T3543.1农作物种子检验规程总则

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本规程。

3.1

聚合酶链式反应(以下简称PCR)

一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

3.2

引物

一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，在3′-OH端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。

3.3

简单重复序列区间(以下简称ISSR)

根据某个简单重复序列(微卫星位点)作为特异引物，通过PCR反应扩增模板DNA链上微卫星位点间隔的碱基序列。

4设备与耗材

2

DB63/T1159—2012

4.1设备

——高速低温离心机；

——PCR扩增仪；

——多用电泳仪及水平式电泳槽；

——紫外凝胶成像系统；

——微量移液器：规格为0.2L-2L，1L-10L，2L-20L，5L-50L，20L-200L，200L-1000L；——电子分析天平；

——磁力加热搅拌器；

——蒸汽压力灭菌锅；

——恒温水浴锅；

——微波炉。

4.2耗材

——离心管：0.2mL，1.5mL，2.0mL；

——研钵；

——移液器吸头：20L，200L和1000L；

——烧杯；

——三角烧瓶；

——PE手套：一次性聚乙烯手套。

5试剂及溶液的配制

5.1试剂要求

试剂需使用分析纯级。配制试剂所使用的水，除另有说明外，使用按GB/T6682规定的一级水。5.2试剂

——CTAB:十六烷基三甲基溴化胺；

——β-巯基乙醇；

——Tris：三羟甲基氨基甲烷；

——PVP：聚乙烯吡咯烷酮碘络合物；

——TaqE：DNA聚合酶，附带6倍loadingbuffer、10倍buffer和25.0mmol/LMgCl2；——dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸；

——λDNA/HindШmarker

——100bp或200bpDNAmarker；

——EB：溴化乙锭

——10倍buffer：10倍反应缓冲液；

——氯化镁；

——6倍loadingbuffer：6倍上样缓冲液；

——Primer：引物；

——EDTANa22H20：乙二胺四乙酸二钠；

——ddH2O：经高压灭菌的二次蒸馏水；

——氯化钠；

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DB63/T1159—2012

——氢氧化钠；

——无水乙醇；

——氯仿；

——异戊醇；

——异丙醇；

——盐酸；

——醋酸；

——石英砂；

——琼脂糖。

5.3溶液的配制

见附录A。

6操作程序

6.1植物样品准备

6.1.1受检样品种子的扦样、分样和保存，按GB/T3543.2的规定执行。

6.1.2测试样品的数量及淘汰值按GB/T3543.5中的规定执行，见附录E。

6.1.3种子按GB/T3543.4规定的方法发芽，取苗龄一周的叶片提取基因组DNA。

6.2DNA