细胞工程制药技术.ppt

杂交瘤技术的基本原理第30页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三杂交瘤细胞的制备1、骨髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第31页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三HAT培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第32页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三2、免疫小鼠免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为100?g，第二次为50?g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06一1×107。第33页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三3、脾细胞的制备(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次；(3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中；(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；(5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中置5分钟；(6)离心(800一1000转／分)计数、备用。第34页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三4、细胞准备（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)；（2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞；（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。第35页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三5、细胞融合(1)将1ml40％的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管；(2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，(4)离心(800转／分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(5)取96孔板，每孔加50?l；(6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50?l；(7)送入5％CO2，温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。第36页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三6、融合后细胞培养(1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的)后每隔2—3天半量换液一次；(2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液；(3)2—3周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；(4)待集落增殖生长至1／3孔时，应进行抗体检测。第37页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三HAT培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第38页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三7、抗体检测免疫荧光试验放射免疫试验(RIA)联免疫吸附试验(ELISA)第39页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三8、单克隆抗体的大量制备体内法培养法第40页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三单克隆抗体的应用单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地用于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性。利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。第41页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三人源单克隆抗体主要困难（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧