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[资料]双酶切连接

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了,,,,,很多次，不过很快改善了,,,,,实验方法，用2周重组了,,,,,14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1、回收PCR产物:在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的,,,,,选择非常重要，尽量选择粘端酶切和,,,,,那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的

BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。

2.纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒

3.酶量的问题:以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下:在50,,,,,μl,,,,,反应液中，30?温度下反应1小时，将1,,,,,μg,,,,,的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。,,,,,而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的,,,,,因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的,,,,,DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物(50体系)约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的,,,,,质量好，

酶切完全切得动。

4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:

摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则,,,,,非常有必要。回收的载体片段:回收的PCR产物片段=1:10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA:(X,,,,,pmoles×长度bp×650)/,,,,,1,000,000,,,,,(注:长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为μg,也可以直接用这个公式

套.1pmol,,,,,1000bp,,,,,DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为

0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

5.测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的,,,,,MARKER每个条带约50ng。6.连接反应:TAKARA的,,,,,连接酶上的,,,,,说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为:在20,,,,,μl的连接反应体系中，6,,,,,μg的λDNA-Hind,,,,,III的分解物在16?下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。而它的浓度为350,,,,,U/μl,,,,,，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。7.转化:

a、全量(10,,,,,μl)加入至100,,,,,μl,,,,,JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。,,,,,b、42?加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。,,,,,

c、加入890,,,,,μl,,,,,AMP阴性培养基，37?振荡培养60分钟。,,,,,

取100μl铺板。也可离心后余100μl

几个非常重要的问题:

1,,,,,做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.

2,,,,,对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干

3对照的设立:

为验证双酶切是否成功,可做如下对照:

A,,,,,酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.,,,,,

做转化时,也要进行对照.,,,,,

设4个:

A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都正常的情况下.

B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒

C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.

D.AMP阴性板上用同一批感