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霉菌的培养及形态观察

实验目的：

1、学习并掌握霉菌形态观察法—小室培养。

2、初步了解四类霉菌（青霉、毛霉、根霉、黑曲霉）的基本形态特征。

3、学习并掌握马铃薯培养基的配制方法和载玻片培养的基本技术。

4、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。

实验原理：

霉菌是可产生复杂分枝的菌丝体。霉菌菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和繁殖菌丝组成，其菌丝比细菌粗几倍到几十倍，可以采取直接制片和透明胶带法观察，也可以采取载玻片培养观察法，通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在盖玻片和载玻片之间的培养基中生长，将培养物直接置于显微镜下可观察到霉菌自然生长状态并可连续观察不同发育期的菌体结构特征变化。

霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌与人类的生活息息相关，如：根霉（Rhizopussp.）是酿造工作中常用糖化菌；毛霉（Mucorsp.）常出现在药酒中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶。黑曲霉（Aspergillusniger）是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶等；青霉（Penicilliumsp.）在工业上，它可用于生产柠檬酸，延胡索酸，葡萄糖酸等有机酸和酶制剂；最著名的抗生素—青霉素就是从青霉的某些品系中提取出来的。

本实验采用载玻片培养观察法，通过无菌操作将薄层培养基琼脂置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，使菌丝体在载玻片和盖玻片之间的营养基中生长，将培养物直接放在显微镜下观察霉菌在自然生长下的形态特征。

放线菌的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，上有一层色彩鲜艳的干粉；菌落与培养基的连接紧密，难以挑取。其孢子的表面结构、形状及颜色在一定条件下比较稳定，是鉴定菌种的重要依据。放线菌在自然界分布很广，绝大多数为腐生，少数寄生。

实验仪器：

菌种：在马铃薯琼脂斜面上培养7天的根霉、毛霉、黑曲霉和青霉。

培养基：马铃薯培养基（PDA）

仪器和其他用品：载玻片、盖玻片、显微镜、镊子、平皿、接种环、U型玻璃棒、20%甘油、5mL移液管、马铃薯、蔗糖、琼脂、纱布、解剖刀

操作步骤：

1、马铃薯琼脂薄层平板的制备

（1）将马铃薯去皮，称量约40g，切成小块煮沸半个小时。

（2）用纱布过滤，再加入4g蔗糖及4g琼脂，溶化后补足水至200mL。

（3）将配置好的培养基倒入试管中约100mL，塞紧棉塞，用牛皮纸包好并做上记号。

（4）将上述试管置于高压蒸汽灭菌锅内于121°C中灭菌30min。

（5）取出试管，通过无菌操作将培养基倒入已灭菌的平皿中，制成马铃薯琼脂薄层平板。

2、配置20%甘油溶液

（1）用已灭菌的移液管取10mL无水甘油于烧杯中。

（2）加入蒸馏水至50mL即配置好20%的甘油溶液。

3、霉菌制片（载玻片培养观察法）

（1）培养小室准备及灭菌：在平皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，在其上放一个U型玻棒，在U型玻棒上放一块载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖，与121°C灭菌30min，烘干备用。

（2）琼脂块制备：通过无菌操作，用解剖刀由马铃薯琼脂薄层平板上切下1cm2左右的琼脂快，将其移至培养小室的载玻片上，盖玻片之下，每片两块。

（3）接种：通过无菌操作，用接种针从黑曲霉、根霉、毛霉或青霉马铃薯琼脂平板培养物中挑取很少量孢子，接种于培养小室中琼脂块边缘上，将盖玻片覆盖在琼脂块上。每个平皿接种两种不同霉菌并做上标记。

（4）培养：通过无菌操作，在培养小室中圆滤纸片上加2mL灭菌的20%甘油（用于保持湿度），盖上皿盖，于28°C培养。

（5）镜检：根据需要于不同时间取出载玻片用低倍镜镜检，必要时用高倍镜观察，记录观察结果。

实验记录：

毛霉青霉

根霉黑曲霉

结果分析:

菌种

毛霉

青霉

根霉

黑曲霉

形态

特征

菌丝无隔，无匍匐菌丝、假根等。孢囊梗直接由菌丝体生出，顶端有球形孢子囊。

菌丝有隔，分生孢子梗不膨大成为顶囊，多次分支形成几轮对称或不对称分生小梗，小梗顶端产分生孢子，为扫帚状。

菌丝无隔，有假根和匍匐菌丝。假根生出向上生出直立孢囊梗，顶端膨大成孢子囊。可观察到有性生殖时产生接合孢子。

菌丝有隔，分生孢子梗顶端膨大成球状，在其表面可辐射状生出一层或两层分生小梗，小梗顶端有成串黑褐色球状分生孢子。分生孢子梗生于足细胞上，并通过足细胞与营养菌丝相连。

注意事项：

注意无菌操作，以防杂菌影响所需要观察的霉菌生长，影响实验结果。

接种量要少并尽可能将分散孢子接种在琼脂块边缘，避免培养