实验二免疫球蛋白的提取.ppt

关于实验二免疫球蛋白的提取第1页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三概述从血清中（或体液中）分离免疫球蛋白就是根据各类免疫球蛋白与其他血清蛋白的分子大小、电离密度、等电点及在水溶液中溶解度不同的特性，将他们分离出来，进而加以纯化。免疫球蛋白的分离与纯化是免疫学实验技术的基础。免疫球蛋白分离与纯化的方法很多，常用的有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法及亲和层析法等。第2页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三凝胶过滤法凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱较快。常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和琼脂糖凝胶等。第3页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三第4页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三离子交换层析法离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。常用的离子交换剂有DEAE纤维素（?球蛋白）和QAE-交联葡聚糖A-50（IgG），二者都是碱性阴离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋白质静电荷变为零，不能吸附，被洗脱下柱。第5页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三第6页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三由于各种蛋白质带电量不同，与离子交换剂结合能力也不同，用一定PH的溶液洗脱即可将它们分开。在碱性溶液中血清蛋白质的解吸附次序是：?球蛋白带电荷最少，首先洗脱；其次为?球蛋白和?球蛋白，最后为白蛋白。第7页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三亲和层析法由于抗原和抗体可发生特异性的可逆结合，先将抗原或抗体等偶联到某种固相载体上装柱，再加入分离样品进行层析。样品中的特异性抗体或抗原被吸附，其它成分则从层析柱下端流出。再用洗脱剂将吸附在柱上的抗体或抗原解离洗脱下来，即可得到纯化的抗原或抗体。第8页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三第9页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三盐析法在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性，并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同，控制盐的浓度，能将血清中免疫球蛋白分离出来。盐析法可用于粗提免疫球蛋白，去掉血清白蛋白等组分。也可用于浓缩免疫球蛋白。第10页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三+++++++-------酸酸碱碱带正电荷的蛋白质（悬浮）在等电点的蛋白质（悬浮）带负电荷的蛋白质（悬浮）脱水作用脱水作用脱水作用+++++++------中和电荷中和电荷带正电荷的蛋白质（悬浮）带正电荷的蛋白质（沉淀）带负电荷的蛋白质（悬浮）第11页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三用于盐析的中性盐一般是硫酸铵。因为其溶解度高且受温度影响小，一般不引起蛋白质的变性。用33.3%的饱和硫酸铵提取免疫球蛋白时，可获得较纯的IgG，但会损失一部分?-球蛋白。用50%的硫酸铵提取IgG时产量较高，但?-球蛋白也会同时沉淀。如要将血清中各种免疫球蛋白都分离出来，可用50%的饱和硫酸铵。第12页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三硫酸铵盐析法提纯血清中的免疫球蛋白第13页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三材料器材：1、紫外分光光度计、磁力搅拌器、离心机；2、三角瓶、吸管；3、透析袋试剂：1、饱和硫酸铵溶液；2、生理盐水；3、血清4.1%BaCl25.奈氏试剂第14页，讲稿共19页，2023年5月2日，星期三