分子生物学实验-PPT.ppt

双酶切体系：试剂用量载体50?lQuickCut-EcoRI2?lQuickCut-HindIII2?l10xQuickCutBuffer5?lH2O41?l总体积100?l混匀上述反应体系，37?C水浴60min；酶切产物的纯化：同PCR产物的纯化，最后用25?l水洗脱。试剂用量PCR纯化产物50?lQuickCut-EcoRI2?lQuickCut-HindIII2?l10xQuickCutBuffer5?lH2O41?l总体积100?l四、pET28a-GFP表达载体的构建（一组一份）目的：学习利用逆转录PCR克隆目的基因以及克隆基因重组表达载体的构建；材料：pET-28a/EcoRI+HindIII：内切酶：EcoRI+HindIII连接酶：SolutionIKan平板：DNA酶切/PCR产物纯化试剂盒：4.1目的基因DNA与载体的连接（一组一份）连接反应：试剂用量pET-28a/EcoRI+HindIII2ulPCR/EcoRI+HindIII8ul连接酶SolutionI10ul总体积20ul室温，连接过夜。4.2BL21(DE3)感受态细胞的制备（1人一份）实验目的：掌握常规的化学法制备大肠杆菌感受态细胞的方法实验注意事项接种培养示范；每组一管5mlLB液体培养基；除离心和培养外，所有操作均在超净工作台完成。2、实验步骤于超净台中，按1%（V/V）的接种量，即取50?L大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种于5mLLB液体培养基中。（一组接种一管）;37℃摇床培养1.5～2.0h至OD600为0.4左右，此时大肠杆菌培养液呈现出一种“雾”状。将装有大肠杆菌培养液的试管置于冰水浴中预冷10分钟。于超净台中，取1.5mL大肠杆菌BL21(DE3)菌液至1.5mLEppendorf管中，4℃，4,000rpm，离心5min。（每人做一份）；弃尽上清液，加入1ml预冷的100mmol/LCaCl2溶液，轻弹管壁重悬菌体沉淀，使之混匀，4℃恒温，4000rpm离心5min。弃尽上清液，加入0.5ml预冷的100mmol/LCaCl2溶液，冰水浴中放置30min。4℃恒温，4000rpm离心5min。弃上清液，将菌体沉淀用100?L预冷的的100mmol/LCaCl2甘油溶液重新轻轻悬浮。置4℃冰箱保存，次日（4-16hr内）使用。五、BL21（DE3）感受态细胞的转化(3.12)BL21（DE3）培养物LB培养基100mMCaCl2Kan平板Kan质粒抽提试剂盒内切酶PCR试剂5.1BL21(DE3)感受态细胞的转化取上次实验连接产物5ul加入到BL21(DE3)感受态细胞（100-200ul）中，轻弹管壁，混匀细胞和连接产物；冰上放置30min；然后将感受态细胞置于恒温金属块中，42?C热激BL21（DE3）感受态细胞90sec；取出感受态细胞冰浴5min；加入1mlLB培养基，放入摇床中37?C，220rpm培养45-60min；5000rpm，离心5min；弃去上清1mL余下100ul菌液重悬，涂Kan平板平板放入37?C生化培养箱中，正置培养30min后，倒置培养过夜（16hr）。次日取出，挑斑接种LB/Kan液体培养基培养（37?C，220rpm）。每人限挑一个斑接种（每组最多4斑）5.2pFastBacHTA质粒的制备（一组一份）方法同pET28a的制备。5.3重组质粒pFastBacHTA-eGFP的构建

（一组一份）制备pFastBacHTA-eGFP/EcoRI+HindIII连接pFastBacHTA-eGFP+eGFP连接产物转化TG1次日挑斑六、重组表达载体的鉴定（3.18）1、目的：学习菌液PCR和酶切鉴定重组质粒的方法2、菌液PCR法3、硅膜法制备质粒DNA4、酶切鉴定重组质粒6.1菌液PCR法鉴定重组克隆（一人一份）挑斑培养约5-6hr后，细菌培养物看起来呈浑浊状，此时通过直接取样用于PCR扩增。取样后，继续培养过夜（16hr）。PCR按如下反应体系操作：试剂浓度用量（ul）H2O/16.510xPCRbuffer/2.5dNTPmix10mM0.5引物110?M1引物210?M1菌液3TaqDNA酶2U/?l0.5总体积25PCR反应条件：94?C,5min94?C,30sec55?C,30sec72?C