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开题报告

生物技术

三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素浓度的变化

一、选题的背景与意义

三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus），隶属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重

要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，肉多，脂膏肥满，味鲜美，营养丰富。每百克蟹内

含蛋白质14克、脂肪2.6克。鲜食以蒸食为主，还可盐渍加工“枪蟹”、蟹酱，蟹卵经漂洗晒

干即成为“蟹籽”，均是海味品中之上品，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。梭子蟹一般在

3-5米深海底生活及繁殖，冬天移居到10-30米的深海，喜在泥沙底部穴居。

目前国内也有人对甲壳动物中有关蜕皮激素做了研究，如叶海辉等采用组织切片和电镜技术，

对锯缘青蟹大颚器、Y器的形态结构进行了观察，以及赵维信、陆剑峰对中华绒螯蟹(Eriocheir

sinensis)Y-器官在蜕皮周期中的超微结构，进而指出其对蜕皮过程的影响。国内很少有人研究三疣

梭子蟹（Portunustrituberculatus）的蜕皮周期，作为中国沿海重要的经济蟹类，刚蜕完壳的软壳蟹

的体积比蜕壳前增加了30%-40%,其壳通过环境中的钙盐等不断硬化而恢复正常硬度，三疣梭子蟹

的个体增长在外表上并不连续，而是呈阶梯形，每蜕一次皮，上一个台阶。由此可见，三疣梭子蟹

的生长发育与蜕皮息息相关，促进蜕皮的发生，可促进其发育成熟，提高产量。了解蜕皮发生的时

间，周期的长短对促进沿海三疣梭子蟹养殖业的发展非常重要。

Y器又称为蜕皮腺，与昆虫的前胸腺为同功器官。1953年Gabe首次描述了58种软甲亚纲

[1]

(Mala—costraca)种类的Y器，而切甲亚纲(Entomostraca)种类没有Y器。Y器分泌的蜕皮类固醇

不具生物活性，只有进入血淋巴，在外周组织20-羟化酶的催化作用下才转化成具有生物活性的20-

羟蜕皮酮。研究表明，20-羟蜕皮酮不仅参与甲壳动物的蜕皮活动和胚胎发育，而且参与了卵巢发

[2]

育过程。如日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)、中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)、中国对虾

(Penaeuschinensis)血淋巴20-羟蜕皮酮的周期性变化均与卵巢发育相关联[3-6]。利用高效液相色谱

-电喷雾串联质谱（LC-MS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴蜕皮激素浓度变化的测定，对

所得数据进行统计学分析，为海洋甲壳动物蜕皮等生长发育过程的生理学研究提供参考。

二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：

研究的基本内容：

1、利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-MS/MS）法完成三疣梭子蟹蜕皮过程中血淋巴

蜕皮激素浓度变化的测定。

2、对所得数据进行统计学分析。

拟解决的问题：

三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素浓度的变化。

三、研究的方法与技术路线：

研究方法

1、实验材料：三疣梭子蟹在宁波宁海长街得水育苗场购得，雌雄各半。体宽在9-11cm之间，体重

在45-65g之间，实验样本均为未经过生殖蜕皮的三疣梭子蟹。

2、参照传统甲壳动物蜕皮阶段的划分，结合三疣梭子蟹类本身所独有的特点，以游泳足末节新旧

表皮间距/旧表皮厚度的比值为主要依据，

1）血淋巴蜕皮激素的提取：从蟹的游泳足基部抽取300μL血淋巴，加入含有1200μL乙腈和20μL

100ng/mL内标的1.5mL离心管内，轻微涡旋震荡，8500r/min高速离心15min。而后吸取上清液

1mL（勿将底部蛋白吸入）于灭菌1.5mL离心管中，做好标记。冰箱下层-20℃保存一周以内。

2）血淋巴蜕皮激素浓度的变化的测量：将上清液旋转蒸发，用0.2mL纯甲醇复溶，进行液质分

析。根据样品20-羟基蜕皮酮（20E）特征离子响应强度与内标物高油菜素内酯的特征离子响

应强度比值，用加入内标的工作曲线法求得样品20-羟基蜕皮酮的含量。

3）绘制统计图表进行分析。

技术路线