基因工程制药.ppt

*包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）第149页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为6mol/L盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。包含体产物分离工艺

（牛生长激素分离提取）第150页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三（1）O-糖基化（Ser,Thr）蛋白质糖基化增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。糖基3蛋白质不能糖基化第151页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖第152页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三因没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性。第153页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三核糖体内质网高尔基体细胞膜合成肽链折叠、组装糖基化运输浓缩加工运输外排线粒体供能第154页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三翻译后加工一级结构的修饰:N-端Met(fMet)去除二硫键的形成个别氨基酸的修饰蛋白质前体中不必要肽段的切除多蛋白的加工羟化作用:羟脯氨酸羟赖氨酸酶活性中心的磷酸化分泌性蛋白一条合成后的多肽链经加工产生多种不同活性的蛋白质/多肽第155页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三信号肽颗粒识别、结合胞浆带有信号肽的分泌蛋白粗面内质网通道识别信号肽酶切除信号肽肽链合并高尔基体进一步加工分泌出胞外带有信号肽的分泌性蛋白的加工、分泌的过程第156页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三第157页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三胰岛素的加工过程第158页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三●多蛋白的加工一条合成后的多肽链经加工产生多种不同活性的蛋白质/多肽第159页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三4产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基，易引起免疫反应。5细胞周质内含有种类繁多的内毒素，其内毒素很难除去。6没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因。第160页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三⑵枯草芽胞杆菌分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。第161页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三⑶链霉菌作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。第162页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三大肠杆菌中的基因表达第163页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：⑴载体能够独立复制。⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。第164页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三松弛型复制pBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆第165页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’第166页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。第167页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第117页，讲稿共232页，2023年5月2日，星期三4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70