重组克隆的单元操作.ppt

已知有两种不同的限制酶都可产生粘性末端：5’-P端突出：3’-OH端突出：第87页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三同尾酶一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。第88页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三HindⅢ5’-A?AGCTT-3’3’-TTCGA?A-5’HsuI5’-A?AGCTT-3’3’-TTCGA?A-5’同裂酶（isoschizomers）有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。第89页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三限制酶识别与切割的靶点序列及其随后的连接同DNA的来源无关，即不带有种的特异性，对各种DNA普遍适用。根据这一特性，才能将不同来源的DNA片段重组成新的重组体分子或是新的基因。第90页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三（五）甲基化酶对内切酶识别的影响为限制性内切酶的伙伴，其识别位点与相应的限制性内切酶相同，并在识别序列内使某位碱基甲基化，对基因组甲基化后，内切酶识别发生的变化：1）封闭了内切酶的切口。如M.EcoRⅠ2）一些依赖甲基化的限制性内切酶的切口产生5′—TCGATCGA—3′5′—TCGA*TCGA*—3′5′—AGCTAGCT—3′5′—A*GCTA*GCT—3′TaqITaqIDpnI第91页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三（五）甲基化酶对内切酶识别的影响3）增加了部分酶的识别特异性。大肠杆菌基因组内存在两种甲基化酶,Dam和Dcm5′—ATCGAT—3′ClaI5′—GA*TCGAT—3′5′—ATCGA*TC—3′4）部分酶对其识别序列内的碱基是否甲基化，不影响切割5′—(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)—3′ClaI第92页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三二、连接酶第93页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三（一）DNA连接酶的作用模式1、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成3′，5′磷酸二酯键的酶5’－末端形成DNA－腺苷酸复合物第94页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三（二）DNA连接酶的两种类型类型I：E.coliDNA连接酶（只连接粘末端）利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物类型II：T4DNA连接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类在基因工程的实验中主要用T4DNA连接酶第95页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三（三）条件（1）连接所需的条件一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基（-OH），而在另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团（-P）；（2）需要有一种能源分子存在以提供羟基与磷酸基团之间形成磷酸二酯键时所需的能量。大肠杆菌及其它细菌中：NAD+（氧化氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）动物细胞及噬菌体中：ATPOH3’5’P第96页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三（四）注意被连接的两条DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分，DNA连接酶并不能连接两条单DNA分子或环化的单链DNA分子。DNA连接酶只能连接并封闭双螺旋DNA分子所出现的切口（Nick），即封闭双链DNA上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的断裂第97页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三GGTAC-OHP-CC-PHO-CATGG5’3’3’5’GG-OHP-CCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’第98页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三三、其他用于DNA重组的工具酶1、DNA聚合酶Ⅰ（来自大肠杆菌）功能：5’→3’的聚合酶活性。5’→3’外切核酸酶活性，3’→5’外切核酸酶利用：5’→3’的聚合酶活性以及5’→3’外切核酸酶活性，切口平移大片段（Klenow片段）：5’→3’的聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶小片段DNA聚合酶Ⅰ第99页，讲稿共145页，2023年5月2日，星期三第100页，讲稿共145页，2023年