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分光光度法测定茯苓药材中总三的含量

椰子是多孔细菌科的一种常见药物。茯苓中主要含有茯苓聚糖、三萜、树胶、蛋白质以及脂肪酸等。中外学者对茯苓的化学成分及生物活性进行研究,发现其所含的大量三萜类物质具有免疫调节、抗肿瘤、拮抗醛固酮,诱导分化白血病细胞系HL—60等药理活性。建立茯苓三萜类的分析测定体系对于茯苓药材内在质量的控制具有重要意义。参考文献并加以改进,建立了测定茯苓中有效成分总三萜类含量的比色法。该方法简便、快速,为中药材茯苓的质量控制提供科学依据。

1仪器和试剂盒

1.1仪器

7530G型紫外可见分光光度计(安捷伦科技上海分析仪器有限公司)。

1.2re达acidc

甲醇、高氯酸、冰醋酸和香草醛均为分析纯。

对照品:多孔菌酸C(polyporenicacidC,自制);采用乙醇提取、醋酸乙酯萃取、硅胶柱层析和高效液相色谱制备等方法精制得到白色柱状晶体,经UV、IR、NMR、MS等鉴定为多孔菌酸C,经HPLC归一化法确认其纯度大于98.0%,可供含量测定用。

2方法和结果

2.1对照溶液的制备

精密称取多孔菌酸C对照品2.2mg,置于25ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用。

2.2测定波长的确定

将多孔菌酸C对照品加显色剂后(同标准曲线项下方法),于紫外可见分光光度计上扫描,多孔菌酸C在540nm处有一吸收峰且空白对照无干扰,故确定540nm为测定波长(见图1)。

2.3显色剂的使用条件的选择

2.3.1用量水

精密吸取多孔菌酸C对照品溶液0.2ml5份,水浴蒸干后各加5%香草醛-冰醋酸0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml,然后再各加高氯酸1.8ml,于70℃中加热20min,取出置冰水中冷却,加冰醋酸5ml,摇匀后在540nm处测定吸收值,结果见表1。

结果显示,0.4ml5%香草醛—冰醋酸为最佳用量。

2.3.2高氯酸用量的确定

取多孔菌酸C对照品液0.2ml6份,水浴蒸干,各加5%香草醛—冰醋酸0.4ml,再分别加高氯酸1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0ml,于70℃水浴中加热20min,取出置冰水中冷却,加冰醋酸5ml,摇匀后在540nm处测定吸收值,结果见表2。

结果显示,1.8ml为高氯酸最佳用量。

2.3.3测定吸光度值

吸取多孔菌酸C对照品溶液0.2ml6份,同上法分别在40,50,60,70,80,90℃测定吸光度值,结果见表3。

实验结果表明,随温度升高,吸收值增加,但水浴超过70℃时,空白显色剂液开始变色,故正文选择水浴温度为70℃。

2.3.4同上法治疗前后,土壤理化性质的变化

吸取多孔菌酸C对照品溶液0.2ml6份,同上法分别在5,10,15,20,25,30min条件下观察、测定,结果见表4。

结果表明,水浴时间20min为最佳时间。

2.4香草醛-冰醋酸溶液的制备

精密吸取上述对照液0.2,0.3,0.4,0.5,0.6ml,分别置具塞试管中,水浴挥去溶剂,冷却,准确加入0.4ml5%香草醛-冰醋酸溶液和1.8ml高氯酸,混匀,密塞。置70℃恒温水浴中加热20min,取出,冷却至室温,加冰醋酸5ml,摇匀,在540nm处测定吸光度,以试剂为空白。以吸光度为纵坐标,多孔菌酸C微克数为横坐标作标准曲线,回归方程为:Y=656.9×10-5X+0.003,r=0.9952,线性范围为17.6～52.8μg。

2.5in稳定性测定

取供试品溶液,按含量测定项下分别在0～60min内进行测定,显示在5～30min内稳定,RSD为2.52%;30min稳定性开始下降。表明:该方法测定需在显色后5～30min内完成。

2.6准确度的研究

取供试品溶液,按含量测定项下测定,RSD为0.93%。

2.7返回率测定

精密称取茯苓粉末(过40目筛)0.3g分别加入对照品2.1mg6份,按“2.8”项下操作,测得回收率,结果见表5。

2.8药渣的提取

精密称取茯苓药材粉末(过40目筛)500mg,置25ml量瓶中,加入甲醇15ml,超声提取90min,滤过,用适量甲醇洗涤药渣;定容至25ml,摇匀。吸取0.3ml,按“2.4”项下操作,代入标准曲线方程,计算含量。

结果表明,不同产地茯苓药材中总三萜含量的大概范围为0.492%～1.02%之间。

3酸比色法测定三类化合物

茯苓中总三萜是其有效成分,对此的测定未见文献报道。冰醋酸一香草醛、高氯酸比色法是测定三萜类化合物常用方法,但其影响因素较多.试剂的用量、反应时温度以及反应后放置时间等因素影响较为显著。本实验结果表明:若在实验中严格控制反应条件,其结果仍较稳定,重现性好,可作为茯苓药材的质量控制