《烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定技术报告》.doc

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《烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定》

技术报告

1前言

烟草中富含茄尼醇，主要用于合成辅酶Q10、维生素K、抗癌增效剂SDB等，是当前市场上炙手可热的医药化工中间体，同时它本身也具有抗菌、消炎和止血的作用。全国每年约有50万吨这样的废次烟叶被焚烧，不仅浪费资源，而且造成土壤碱化，对生态环境造成污染，如果这些废次烟叶全部变废为宝提取茄尼醇，能产生近百亿元的经济效益，既保护了生态环境，又能充分利用烟草生产产业的废弃物，实现烟草资源的高值化利用[1-8]。从烟叶提取的茄尼醇产品中茄尼醇含量直接决定了它的市场价格，因此迫切需要规范、准确的检测方法来检测其含量。检测茄尼醇的方法很多，有库伦滴定法[9]、气相色谱法[10]、HPLC法[11-17]及液质联用法[18]。其中库伦滴定法其中重现性差；气相色谱法要经过衍生反应，样品处理麻烦；液质联用法所用仪器设备比较高端，应用不普遍；液相色谱检测结果比较理想，但方法很多，色谱条件各有不同，目前尚无统一、规范的相关检测的标准方法，因此，经国标委批准，我们制定了国家标准《烟叶和烟叶提取物中茄尼醇的测定高效液相色谱法》，使检测结果更加规范和准确可靠，从而能够更加科学地评价烟叶和烟膏的市场价值。

2实验部分

2.1仪器与试剂

2.1.1仪器：

Waters2695高效液相色谱系统，Waters2996二极管阵列（PDA）检测器（或紫外检测器），Millennium32色谱工作站，粉碎机（天津太斯特仪器有限公司），超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，恒温振荡器、离心机（金坛市江南仪器厂），XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，索氏提取装置（金坛市晶玻实验仪器厂），微量可调移液器（Eppendorf），脱脂中速滤纸（ф=15cm杭州特种纸业有限公司），滤膜（0.2μm，直径25mm的聚砜膜或相当者）。

2.1.2主要试剂：

茄尼醇标准品（Sigma，纯度≥99.9%，美国），异丙醇（山东禹王）、甲醇（HPLC级，TEDIA，美国），水为超纯水（蒸馏水再经过Millipore超纯水系统制备），正己烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、氢氧化钠均为分析纯。

2.1.3材料：

烤烟由福建省三明金叶复烤有限公司提供；白肋烟由中国烟草白肋烟试验站（湖北省烟草科研所）提供；香料烟由湖北省十堰市郧西县烟叶分公司提供；烟膏由烟草提取，自制。

2.2标准溶液的配制

标准储备液：精密称取茄尼醇标准样品0.05g（精确到0.0001g），用正己烷溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，制成0.50mg/mL标准溶液，4℃冰箱内保存。

标准工作液：准确移取0.1、1、2、3、4、5mL茄尼醇标准储备溶液（4.7）于50mL棕色容量瓶中，用流动相溶液稀释并定容至刻度，得到一系列的标准工作溶液（质量浓度分别为1、10、20、30、40、50μg/mL），现配现用。

2.3样品分析

2.3.1样品的制备

试样的制备将烟叶在55℃的通风干燥箱中干燥至恒重，冷却至室温，粉碎，过40目筛。制备后烟叶粉末应保存于干燥器内备用。。

2.3.2样品前处理

2.3.2.1烟叶：

（1）茄尼醇的提取

称取约2g（精确至0.0001g）烟叶粉末于50mL具塞离心管中，加正己烷20mL，旋涡振荡2min，于65℃超声波萃取15min，萃取功率为250W，4000r/min离心10min，上清液移入50mL容量瓶中。用15mL正己烷重复以上振荡、萃取和离心步骤，将沉淀物重复提取2次，合并正己烷层于50mL容量瓶中，定容至刻度。

（2）游离茄尼醇测定的试样处理

准确移取4mL2.3.2.1（1）提取液于10mL具塞离心管中，加入约6mL蒸馏水，涡旋振荡3min，去除水溶性杂质，4000r/min离心10min分层；

准确移取1mL净化后上层正己烷提取液，用流动相稀释并定容至25mL棕色容量瓶中（如茄尼醇浓度超出标准曲线线性范围，则适当调整分取体积和定容体积），经0.2μm滤膜过滤，滤液待上机测定。

（3）总茄尼醇测定的试样处理

准确移取4mL2.3.2.1（1）提取液于100mL具塞棕色三角瓶中，加入4mLNaOH乙醇溶液（0.02mol/L），密封好塞子，充分混匀，在恒温振荡器中60℃～65℃水浴振荡，皂化30min；皂化后溶液在83℃～87℃水浴蒸发至近干；准确移取2mL正己烷于三角瓶中，超声2min溶解残渣，转移至另一洁净10mL具塞离心管中，重复一次以上操作溶解三角瓶中残留物转移至离心管中，再用蒸馏水约6mL多次洗涤三角瓶，合并溶液于具塞离心管中；涡旋振荡具塞离心管3min，去除水溶性杂质，离心10min分层；准确移取1mL净化后上层正己烷提取液，用流动相稀