2024届高三生物一轮复习课件PCR技术与电泳相关问题.pptxVIP

微专题10PCR技术与电泳相关问题

1.原理与条件一、PCR的原理

2.PCR过程结论：①n次复制后含有引物A的_______个。含有引物B的_______个。同时含有引物A和B的_______个。②从第____次扩增开始能够获得单纯的目的基因。2n-12n-12n-23

例.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列B.设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连C.复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16D

若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)?DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′②④

3.引物的基本要求：?引物自身不能环化?两种引物之间不能互补配对?引物长度不宜过短，防止引物随机结合

（1）传统PCR结果分析对扩增后的DNA染色处理后凝胶电泳分离。DNA电泳是根据DNA分子大小来分离和识别DNA片段的技术。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。缺点：只能作定性分析，不能准确定量。易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。4.PCR的结果检测

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。（2）（实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR）

rRT-PCR可以分两部分来看，其中r代表实时（real-time），主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。；RT表示逆转录（reversetranscription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA（图1）。2019-nCoV核酸检测优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据。

二.PCR的应用（1）检测是否被病毒感染（2）反向PCR测定未知DNA区域（3）PCR定点突变技术—重叠延伸PCR

P345例1变式.(2022·扬州市高三期中)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（）（1）检测是否被病毒感染

下列说法错误的是（）A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交C

P345例2.(2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有________种。图1为新冠病毒的“ORFlab”基因对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的________(子链延伸方向为其自身的5′→3′，用图中数字作答)。若已知该基因的一条引物，________(填“能”或“不能”)依据其碱基序列设计出另一条引物，理由是________