遗传学课件12第十二章(遗传工程).pptVIP

遗传学课件12第十二章（遗传工程）;广义生物工程：细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工程;基因工程;基因工程的特点;植物表达载体的构建;第二节基因的分离;一、工具酶;细菌（宿主）本身的DNA通过甲基化酶的作用，使DNA得到修饰，免遭自身限制性内切酶的破坏。;Ⅱ型限制性内切酶：

酶切部位有特异性，能识别DNA分子上特定的DNA序列。;Ⅱ型酶有几个基本特性;表12-1不同限制酶的识别、切割和修饰位点;echo-r-one;;（二）DNA连接酶;在分子克隆中使用的DNA连接酶有两种。

即大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶。

两种DNA连接酶都不能催化单链DNA之间的连接反应，被连接的DNA链必须是双链DNA分子的一部分。

T4DNA连接酶还可以催化二个具有平齐末端的双链DNA片段之间的连接反应，而大肠杆菌连接酶一般不具有这种活性。;（三）反转录酶;cDNA文库代表的是某一特定细胞，或组织，或某一发育阶段的表达的基因，而基因组文库代表的是基因组中所有的基因。;（四）聚合酶链式反应;PCR反应已经自动化，在PCR仪（thermocycler）上进行。

基本过程：

通过高温，双链DNA变成单链DNA——变性；

通过降低温度，使引物和摸板配对——退火;

利用耐热DNA聚合酶,合成产物DNA——延伸。

变性温度：93-94℃，30-60秒

退火温度：36-60℃,30-60秒

延伸温度：72℃,1.5-2分

循环30-40次;

最后72℃补齐10分钟。;;循环数;图12-6在紫外灯下观察到的琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带;二、载体(vector);重组DNA的步骤;图12-5重组DNA技术流程;（二）载体(vector);1、质粒载体;α互补：

α互补是指大肠杆菌β-半乳糖苷酶的两个无活性片段组合成为功能完整的酶的过程。

α受体片段：酶的C端片段，一般存在于宿主细胞。

α供体片段：酶的N端片段，一般存在于质粒载体。

α供体片段+α受体片段有活性;质粒载体含有LacZ基因的N端编码序列，在编码区含有多克隆位点，不影响酶的活性，选择含有β-半乳糖苷酶C端片段的宿主细胞。

在含有X-gal（5-溴-4-氢-3-吲哚-β–D-半乳糖苷）的培养基中形成兰色菌落，但如果外源DNA插入到多克隆位点，将绝??地产生不具有α互补功能的N端片段产生，菌斑为白色。;图12-6重组质粒的蓝白斑筛选;2、病毒载体;3、克隆大片段DNA的载体;图12-11黏粒载体pJB8图谱;细菌人工染色体（BAC）;酵母人工染色体（YAC）;三、基因的分离;;cDNA文库与基因组文库的不同;2．从基因库中分离特定的克隆序列(基因);(2)筛选文库;（3）阳性克隆的分析与鉴定;（二）T-DNA标签克隆基因;（三）PCR扩增基因;（四）人工合成基因;第三节外源基因的导入;2．电激转化（electroporation）

是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆的电穿孔，以使DNA分子进入细胞。进行电转化操作时，细菌细胞和DNA分子放在带有电极的小室中，通过小室（chamber）施加电脉冲，使细胞壁穿孔，然后DNA分子进入细胞。电转化的频率通常是10-6~10-9，因质粒的大小而异。;3．结合（conjugation）结合是原核生物细胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一种自然过程。;二、植物表达载体;Ti质粒;T-DNA两端各有一段25bp的重复序列（分别称为左边界序列和右边界序列）。

T-DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的基因，称为致瘤基因，T-DNA的右端序列对T-DNA转移到植物细胞内具有重要意义。保留T-DNA两端的末端序列，然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力。;Vir区段总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种：一种是组成型表达，即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平；另一种是植物诱导型表达，即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达。;三、外源基因导入植物;三、外源基因导入植物;2、转化方法;3、选择系统

抗生素抗性基因，如NPTII基因（新霉素磷酸转移酶基因），能分解卡那霉素等抗生素。

其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报告基因{如：GU