第二章基因工程的酶学演示文稿.pptVIP

3’隐蔽末端的DNA片断Klenowfragment补平根据末端的顺序选择一种?-32P-dNTPs末端标记的DNA限制性内切酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’5’----G3’3’----CCTAG5’5’----GG3’3’----CCTAG5’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’EcoRIBamHI?-32P-dATP?-32P-dGTP25oC1h本文档共114页；当前第62页；编辑于星期六\10点45分③cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物本文档共114页；当前第63页；编辑于星期六\10点45分（1）T4DNA聚合酶的性质3.T4DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。①来源②酶活性本文档共114页；当前第64页；编辑于星期六\10点45分③特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。本文档共114页；当前第65页；编辑于星期六\10点45分5’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚合酶无dNTPsT4DNA聚合酶有dNTPs5’5’本文档共114页；当前第66页；编辑于星期六\10点45分（2）T4DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法）用3’?5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。再利用它的5’?3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。①补平隐蔽末端②DNA3’末端标记本文档共114页；当前第67页；编辑于星期六\10点45分酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4DNA聚合酶（3’?5’外切）DNA酶切片断T4DNA聚合酶（5’?3’聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’内切酶切无dNTPs本文档共114页；当前第68页；编辑于星期六\10点45分a.放射性标记的优缺点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。优点：缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害。要求在专门实验室操作。本文档共114页；当前第69页；编辑于星期六\10点45分b.非放射性标记i）生物素标记：生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（biotinligase）催化与蛋白质共价结合。本文档共114页；当前第70页；编辑于星期六\10点45分纯化的DNA片断DNaseI制造单链缺口DNAPolI进行缺口转移生物素-dTTP和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中本文档共114页；当前第71页；编辑于星期六\10点45分光促生物素标记生物素连接臂光敏基因探针序列探针序列生物素连接臂光敏基因+光照本文档共114页；当前第72页；编辑于星期六\10点45分抗生物素蛋白（avidin）：链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：生物素的识别——亲和素：是一种鸡卵清蛋白。细菌中avidin的类似物。能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：本文档共114页；当前第73页；编辑于星期六\10点45分ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒(kit)。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。本文档共114页；当前第74页；编辑于星期六\10点45分本文档共114页；当前第75页；编辑于星期六\10点45分iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRPO）碱性磷酸酶（Alkalin