鮰鱼骨胶原多肽-钙螯合物的制备及其理化性质的研究.pdf

摘要

钙是人体不可缺少的矿物质元素，对人体具有重要的调节作用，而缺钙易导

致各种不良疾病的发生，成为亟待解决的问题。无机钙制剂和有机钙制剂在人体

肠道中易形成难溶性盐导致吸收率低，而肽-钙螯合物生物利用度高，因此受到

广泛的关注。鮰鱼是我国重要的淡水鱼之一，鮰鱼骨作为鮰鱼加工副产物之一，

常被丢弃或加工成鱼饲料，导致其附加值低。因此，本论文以鮰鱼骨为原料，先

研究鮰鱼骨胶原多肽的酶解工艺及其螯合物的稳定性；再采用凝胶柱分离纯化鮰

鱼骨胶原多肽，制备钙结合能力最佳的鮰鱼骨胶原多肽组分，运用光谱、扫描电

镜（Scanningelectronmicroscope,SEM）、能谱、质谱和细胞实验研究最佳组分及

其钙螯合物的理化性质。主要研究内容和结果如下：

（1）以鮰鱼骨为原料，以钙结合活性为评价指标，通过单因素试验得到鮰

鱼骨胶原多肽的最佳酶解工艺，并对鮰鱼骨胶原多肽及其肽-钙螯合物进行氨基

酸组成分析；再评价鮰鱼骨胶原多肽-钙螯合物的稳定性。结果如下，鮰鱼骨胶原

多肽的最佳酶解工艺为：料液比1:13（g:mL），酶添加量4%，pH8.0，酶解时间

2h，酶解温度40℃，其钙结合能力达29.37mmol/L。鮰鱼骨胶原多肽-钙螯合物

的Asp、Glu、His、Lys含量分别比鮰鱼骨胶原多肽增加了4.92%、9.05%、2.33%、

0.5%。经稳定性分析，鮰鱼骨胶原多肽-钙螯合物具有一定的耐热性、耐弱碱性

和消化稳定性。说明鮰鱼骨胶原多肽-钙螯合物具有一定的稳定性，为肽钙螯合

物的开发提供理论基础。

（2）采用SephadexG-25凝胶柱分离纯化鮰鱼骨胶原多肽，制备钙结合能力

最佳鮰鱼骨胶原多肽组分；再运用傅里叶红外光谱（Fouriertransforminfrared

spectrometer,FTIR）、SEM和能谱对最佳鮰鱼骨胶原多肽组分及其钙螯合物进行

结构表征，并利用液相色谱-串联质谱（Liquidchromatography-tandemmass

pectrometry,LC-MS/MS）鉴定螯合物中的肽段序列。经SephadexG-25凝胶柱分

离得到3个组分（F、F、F），F组分的钙结合活性最佳，制备的肽-钙螯合物

1233

为F-Ca。经FTIR表明，F的氨基、羧基和酰胺键为Ca2+的主要结合位点。SEM

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表明F3与Ca2+螯合后，其表面形貌由光滑变为粗糙、疏松、多孔；能谱表明F3

螯合后，钙含量明显增加；表明有螯合物的产生。经LC-MS/MS分析，F-Ca中

3

的多肽分子质量大小在450~915Da之间，含有Asp或者Glu的肽段（平均局部

置信度得分（ALC）≥99%）有44条，说明Asp、Glu在多肽与钙螯合的过程

中有重要的作用。

I

（3）通过建立Caco-2细胞单层模型，研究F-Ca在细胞中的钙吸收效果。

3

以跨膜电阻值（Transepithellalelectricresistance,TEER）确定Caco-2细胞单层膜

2

的完整性。在21d时，Caco-2细胞单层膜TEER值为674.61Ω×cm，表明已分

化成紧密的细胞单层，可用于吸收实验。F-Ca、CaCl、酪蛋白磷酸肽-钙螯合物

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（CPPs-Ca,Caseinphosphopeptides-calciumchelate）经Caco-2细胞单层膜吸收，

在转运时间30、60、120