荧光定量PCR原及其应用.pptxVIP

荧光定量PCR的原理及其应用;二+操作及结果分析

<-）.样品制备

｛二）.引物及探针的设计与合成

（二）.W准品的制备一质粒或纯化巵的PCR产物通道的选择及增益的选择

（五〉.t小准曲线的边

（/<）.加样时应注意的细节

（七）.阈值的选定

（八）.熔解曲线分析

（/L）.操作流程

三.应用

<-）.绝对定品分析

<二〉.ffl对定帘分析及丈验方案

（二）.SNP怜测分忻;一、原理概述;一、原理概述

2.定UPCR常用的三个常ffl概念

扩增曲线、荧光阈位、Ct值

(1).扩増曲线：反映PCR循环次数和荧允强度的曲线，定M：PCS仪毎次轮PCR扩増郁会自动决尖光强沒的变化;原理概述;MolecularBeacon分子信fe;原理概述;原理概述;一、原理概述;一、原理概述;一、原理概述;一、原理概述;一、原理概述;原理概述;-、原理概述;、原理概述;、原理概述;原理概述;二、操作及结果分析

1、样品的制备;操作及结果分析;二、操作及结果分析

參

3、标准品的制备一质粒或纯化后的PCR产物*'

这一步骤一般在预实验时完成，严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶i收，并进行质粒的ii接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠打菌中增位后提取质粒，并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的0D仍，借此来确定质粒的雌；J<1，将已知摩尔量的质粒做5倍或W倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中g的棊因模板量的定量棊础。

现仵也有的不做质粒，A:接测定纯化后的PCR产物的嶒尔然后梯嗖稀杼PCR产物，以此來作为标准品。;—、;二、操作及结果分析

5、标准曲线的达立;二、操作及结果分析:::;二、操作及结果分析::::

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7、阈值的没定**

定品PCR反应结时开始对结束进汀分析，此吋芯嬰划定阈值，也就足在扩增曲的指数期划-条直线，这条线就叫阈值线，在阈值线上，所有的样品的荧光值都-致相同，不同的只是所对应的CT值和初始模板ft!

阈値的设定耍尽!|1:讣问归系数鉍人！;二、操作及结果分析;HeterozygoteAmplifiedfail;二、操作及结果分析;三、荧光定量PCR技术的应用

1、绝对定量分析

这坫荧光定斌PCR技术的R接应用tnJ■用f检测病靑及细蘭的浓度!;三、荧光定量PCR技术的应用:：：-

鲁*?

2、相对定量分析及实验方案

届冈衣达(geneexpression)足指细胞江生命过程屮，把储存在DNA顺汴屮遗传位息经过转忒和翻讦，H变成具有生物活性的蛋白质分子.遗传物质DNA汽先要把所携带的转籴成人1^使RNA(mRNA)，携带遗传信息的mf?NA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加T：后变成蛋闩质，至此遗传物质DNA完成/发达过程。期阆的转蛾过程足棊㈥衣达中非常蚤要的调节步骤，所转彔的mRNA的多少直接影响芯扣关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内父条坫HmRNA含Q多少的分析，就能大致判断出该条袪N的衣达记古活跃，;三、荧光定量PCR技术的应用

2、相对定量分析及实验方案;、】????

三、荧光定量PCR技术的应用::::

鲁*?

2、相对定量分析及实验方案一双标准曲线法"

所旧的权标准曲线法就足对内餐码㈨和所研宄的n的基闪都做绝对定頊，然g将斤生理阶段的ri的埔闪的吊和内参棟闪的黾相除，得出一个比值：鉍后再将不同生玴阶段所w的比值相除，mwuiH的基w在不m牛.理阶段的衣达变化，;三、荧光定量PCR技术的应用

2.Delta-deltaCt法

此让坫泾记4的数7原迎推哇而來;;通常所说的SNP都是二等位名态性的，转换的发生率总是明显卨丁其它几种变计，具有转换型变界的SNP约占2/3,其它几种变异的发生几率相似。转换的儿率之所以品，吋能足闵为CpG二核苷酸k的胞嘧啶残柚是人类摧因组屮最易发生突变的位点，其中人多数是甲娃化的，可自发地脱去S基而形成胸腺嘧啶。;三、荧光定量PCR技术的应用

3、SNP检测分析;;戶;1;荧光定量PCR图片;似善141Ij;?谢谢合作