《烤烟品种鉴定技术规程 SSR分子标记法》技术报告.docx

烤烟品种鉴定技术规程SSR分子标记法

技术报告

中国农业科学院烟草研究所

2023年5月

目录

TOC\o1-3\h\z\u1．前言 1

2．材料与方法 2

2.1供试材料 2

2.2供试SSR标记 3

2.3供试材料全基因组DNA提取 3

2.4PCR扩增及电泳检测 3

2.5变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（PAGE） 3

2.6毛细管电泳 5

2.7数据分析 5

3．供试群体遗传的多样性分析 5

4．最少引物数评估 14

5．构建供试群体的SSR标记指纹图谱 15

6．烤烟DUS分子检测的核心SSR标记 18

7．结论 28

附件1 30

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1．前言

植物新品种在农业增产、增效和社会经济活动中起着至关重要的作用，对植物新品种实施知识产权保护，是当今国际通行的做法和人类文明进步的标志。开展新品种保护离不开一系列技术条件的支撑，其中新品种的特异性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和稳定性（Stability）测试就是植物新品种保护的技术基础和科学依据。1999年我国正式加入《国际植物新品种保护公约》，成为国际新品种保护联盟（InternationalUnionForTheProtectionOfNewVarietiesOfPlants，简称UPOV）的成员国。随后以UPOV的DUS测试指南为范本，制定了一系列适合我国特点的农作物DUS测试指南，并在植物新品种保护方面推广应用。2017年5月1日起实施的《非主要农作物品种登记办法》第十二条明确规定，申请登记的品种应当具备特异性、一致性、稳定性。在国际上UPOV于2002年首先发布了烟草DUS测试指南，随后我国学者依据《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则》（GB/T19557.1-2004），同时参考UPOV的测试指南制定并发布了我国首个烟草DUS测试标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟》（YC/T369-2010）。

DUS测试是一个复杂的技术检测过程。目前，我国及国际上通行的新品种DUS测试标准主要是建立在部分生物学性状（包括农艺性状、品质性状和抗逆性状等）的田间测定基础上，如在我国烤烟DUS测试指南中就规定了35个基本性状，其中16个为必测性状。由于主要以植物的表观形态特征为基础，因此在对测试品种与标准品种、近似品种进行测定和比较分析时，鉴定结果容易受环境因素的影响，在测试过程中也经常出现因不同测试人员对性状的认识存在偏差，导致某些性状代码判定结果不一致的问题，同时巨大的工作量还会进一步加大测试误差。以分子标记为基础的分子检测技术具有测试周期短、不受环境影响、易于自动化等优势，是DUS快速测试技术的发展方向。在众多分子标记技术中，SSR(SimpleSequenceRepeats)标记具有数量丰富、稳定重复性好、多态性高、共显性、操作简单等优点，被认为是植物新品种DUS测试中较理想的标记技术，已经成功应用于多种农作物标准品种的指纹图谱构建及DUS测试中。因此，本研究拟针对烟草新品种DUS测试工作中缺少分子标记检测技术的现状，利用DUS测试标准品种筛选并构建SSR分子标记指纹图谱，进而形成可用于烟草区域试验参试品种的特异性鉴定方法，为烤烟新品种的审定和保护提供坚实的技术基础。

2．材料与方法

2.1供试材料

本研究所用烤烟DUS测试标准品种（见表1）由国家烟草种质资源中期库提供。

表1.本研究所用烤烟DUS测试标准品种

编号

资源编号

品种名称

资源类型

典型性状

SV01

2290

NC82

引进

椭圆形叶形

SV02

485

小黄金1025

地方

叶数少、黑胫病感病

SV03

1084

G28

引进

叶宽宽、叶长宽比小、宽椭圆形叶形、感CMV

SV04

2490

中烟90

选育

纵向叶面急弯、叶面较皱、叶缘皱折

SV05

1365

中烟15

选育

花序密集

SV06

2243

Coker176

引进

叶耳大、中等花冠尖

SV07

2293

NC89

引进

叶厚较厚、横向叶面平、叶面平整、叶色绿

SV08

2266

K326

引进

株型塔形、腋芽少、长椭圆形叶形、叶尖渐尖、横向叶面凹、纵向叶面微弯、波浪叶缘、花色淡红

SV09

3660

中烟100

选育

叶缘微波、花长短

SV10

540

红花大金元

选育

叶面平整、花冠小、花色红

SV11

503

革新三号

选育

抗黑胫病、中抗TMV

SV12

520

净叶黄

选育

抗赤星病

SV13

4820

中烟103

选育

叶缘皱折

SV14

2318

G140

引进

感赤星病、感TMV

SV15