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细菌 DNA 提取方法 细菌 dna 提取方案细菌 DNA 提取方案 细菌 DNA 提取方案：革兰氏阴性菌，如 E.coli，一般有三种可以选择的方法。 一、水煮模板法——主要用于 PCR 反应 1、接种单菌落于 LB 或脑心平板，连续画线，37 摄氏度培养 18－24 小时。 2、刮取 1～2 接种环菌苔加入 150 微升三蒸水中，混匀，100 摄氏度煮沸 10 分钟。 3、12000 转/分钟 离心 10 分钟，取上清，－20 摄氏度保存备用。 操作最简便，对试剂条件要求低。缺点是纯度不够高，可能会含有 RNA、蛋白等杂质。但是作为一般检测目的的 PCR 反应模板已经足够了。 有人称扩增 4kb 以下片段都可用此种方法制取模版，编者用此类模板PCR 可以扩增到 3500bp 的片段。编者建议：此法得到的模版保存时间短， 强烈建议每月重新制作一次。 二、CTAB/NaCl 法 1、接种一单菌落于 5mlLB 中,30℃培养过夜, 2、取 1ml 种子培养液接入 100ml2%LB 中,37℃、220r/min 培养 16 小 时; 3、5000r/min 离心 10 分钟,弃去上清。 4、加入 10mlTE 离心洗涤后,用 10mlTE 溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。 5、取 3.5ml 菌悬液,加入 184μl10%SDS,混匀,加入 37μl10mg/ml 蛋白酶 K,混匀,37℃温育 1 小时 6、加入 740μl5mol/LNaCl,再加入 512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育 10 分钟。 7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。 8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混 匀,10000r/min 离心 5 分钟,保留上清。 9、加入 0.6 倍的异丙醇,混匀,10000r/min 离心 5 分钟,收集 DNA 沉淀, 用 70%乙醇离心洗涤 DNA 沉淀。 10、用 1mlTE 溶解 DNA,加入终浓度为 20μg/mlRNaseA,4℃保存。CTAB/NaCl 法提取的 DNA 纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编 者更喜欢把终浓度为 20μg/ml RnaseA 加在第 5 步温育的时候，这样最后没有 RnaseA 污染。每一步操作细致一些，得到的 DNA 可用于 Southern blot。编者建议：长时间保存 DNA 可放于-20℃，但要尽量减少反复冻融，否则影响 DNA 质量。 细菌 dna 提取方案三、盐析法 1、1.5ml 对数期菌液 2、12000rpm 30 s 3、200ul 裂解液（同 CTAB/NaCl 法），37c,1hr 4、66ul 5M NaCL,混匀充分，12000rpm 10min 5、上清用粗枪头取至新管 6、等体积酚充分混匀，12000rpm 3min，反复抽提至无蛋白层 7、取水层，等体积氯仿混匀，12000rpm 3min 8、上清至新管，2 倍体积预冷无水乙醇9 、 -20C，20min，14000rpm， 15min 10、400ul 70%冷乙醇洗涤 11、干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min 12、2 倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤 13、干燥，溶于 100ul TE 介于方法一和方法二之间，CTAB 虽然取出糖分效果较好，但 CTAB 本身也是有毒的，所以此方法放弃了 CTAB。 革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取 CTAB/NaCl 法稍加修改，在第四步加入终浓度 2mg/ml 的溶菌酶，37 度温育 1h。 实验注意：提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速 过一下，使其断口圆滑）。以免枪头损伤基因组！抽干时最好是风干！ 细菌基因组 DNA 的提取方法综述，提供了 5 种方法。 快速微量提取法 取 1.5ml 菌体培养物于一灭菌 Ep 管中，12000rpm 离心 1min, 丢去上清夜，收集菌体。 加入 400ul 裂解液（40mMTris-醋酸，20mM 醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于 37oC 水浴 1hr。 然后加入 200ul5mol/L 的氯化钠溶液，混匀后于 13000rpm 离心 15min。 取上清液，用苯酚抽提 2 次，氯仿抽提 1 次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20 度保存1 小时后，13000rpm 离心15min，弃上清液，沉淀用 70%乙醇洗 2 次；置于室温干燥后，溶于 50ulTE 溶液中， 置 4℃保存备用。 蛋白酶/SDS 法制备细菌 dna 提取方案 先用 10ml 含适当抗生素