血清γ球蛋白的分离、纯化与鉴定.pptVIP

一、目的和要求 学习盐析法分离血清蛋白的原理和技术 掌握凝胶过滤层析法脱盐的基本操作技术 掌握用醋酸纤维膜电泳法分离血清蛋白的原理及方法 本文档共23页；当前第1页；编辑于星期一\3点19分 二、原理 （一）盐析 1.概念和原理 盐析是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。 蛋白质在纯水中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”(salt in)。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析” (salt out) 。 本文档共23页；当前第2页；编辑于星期一\3点19分 “盐析”破坏了蛋白质作为亲水胶体的两个稳定因素 但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水化膜 另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互排斥的电荷相互聚集沉淀出来 表面电荷 水化膜 本文档共23页；当前第3页；编辑于星期一\3点19分 2.常用中性盐： 盐析可用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐，其中运用最广的是硫酸铵。 硫酸铵的优点 1. 在水中化学性质稳定， 2. 溶解度大， 3. 溶解度的温度系数变化较小， 4. 硫酸铵价廉易得，分离效果好， 5. 性质温和，高浓度时也不会影响蛋白质的生物学活性。 本文档共23页；当前第4页；编辑于星期一\3点19分 3.盐浓度计算 各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度各异，所需的最小盐量称做盐析浓度。 A，G A G ↓ 半饱和(NH4)2SO4 饱和(NH4)2SO4 A ↓ 血清中清蛋白和球蛋白的分离 按体积： 1 2（50%）； 1 4（25%） 本文档共23页；当前第5页；编辑于星期一\3点19分 (1)饱和硫酸铵溶液法 将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1 按体积： 1 2（50%）； 1 4（25%） (2)固体硫酸铵法 可采用直接加入固体硫酸铵的方法。 硫酸铵饱和度的计算 本文档共23页；当前第6页；编辑于星期一\3点19分 离心力(F)等于被离心的物体质量与向心加速度的乘积 向心加速度 = 4π2V2r （其中V为每秒的转数，r为离心半径，单位cm） F=m 4π2V2r 相对向心加速度= 4π2V2r g 多少个g （二）离心 (centrifugation) ---- 分离 1.离心力 本文档共23页；当前第7页；编辑于星期一\3点19分 2.离心机分类 根据离心机的转数分类可以分为三类 ① 5000rpm 普通离心机 ② 5,000-25,000rpm 高速离心机 ③ 25,000-10,000rpm 超速离心机 因离心时与空气摩擦产热很多，所以高速离心机有制冷装置 超速离心机不但有制冷装置，而且离心室密封真空 本文档共23页；当前第8页；编辑于星期一\3点19分 3.离心机的使用 0.1g 50g 2000rpm r=12cm 配平 在对称位置重量一致 Balanced loading patterns for a 12-positon centrifuge rotor 本文档共23页；当前第9页；编辑于星期一\3点19分 三、操作 2ml血清 + 2ml PBS 逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 2ml 2→ 6ml 33% 弃上清，2ml PBS + 1ml 饱和 (NH4)2SO4 1→ 3ml 33% 弃上清，1ml PBS + 0.5ml 饱和 (NH4)2SO4 0.5→ 1.5ml 33% 弃上清， 洗涤 0.5ml PBS 溶解 ↓摇匀 ↓ 混匀静置30min，离心3000rpm 10min ↓ ↓ 混匀静置30min，离心3000rpm 10min ↓ 混匀静置30min，离心3000rpm 10min 本文档共23页；当前第10页；编辑于星期一\3点19分 层析利用物质在固定相（stationary phase）与流动相（mobile phase）之间不同的分配比例，达到分离待测物质的技术。 (三)层析(chromatography) ---纯化 凝胶过滤层析法（gel fi