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差别显示技术详解演示文稿 本文档共20页；当前第1页；编辑于星期六\4点9分 优选差别显示技术 本文档共20页；当前第2页；编辑于星期六\4点9分 高等生物大约有3~5 万个不同的基因，在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有10%~20%的少部分基因被选择性表达，这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或相同组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年来，该领域的研究取得了很大进展， 扣除杂交（subtractive hybridization, SH）、基因芯片技术（DNA chip technique）、基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体库技术(phage display antibody repertoire library technique)和双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis)先后成功地建立。 一. 概述 本文档共20页；当前第3页；编辑于星期六\4点9分 基因表达调控的一种方式。指在对信号或诱导物做出应答时，选择表达不同的基因，或使基因的表达水平有所不同。 基因差异表达 本文档共20页；当前第4页；编辑于星期六\4点9分 DD的发明及其基础 由Liang于1992年创立 是分离差异表达基因强有力的工具 在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）以特定引物进行的PCR技术 3）DNA电泳技术 本文档共20页；当前第5页；编辑于星期六\4点9分 二.基本概念 mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。 本文档共20页；当前第6页；编辑于星期六\4点9分 反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 反转录PCR 本文档共20页；当前第7页；编辑于星期六\4点9分 RNA指纹 RNA 首先在逆转录酶的作用下使RNA 逆转录为DNA，之后以其DNA 为模板，通过以DNA指纹技术建立指纹图谱进行分析。 DNA指纹 某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变反映出来，此即限制性片段长度多态性(RFLP)。其主要原因是由于DNA序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度的酶切片段． 本文档共20页；当前第8页；编辑于星期六\4点9分 水稻品种DNA指纹 本文档共20页；当前第9页；编辑于星期六\4点9分 基本原理 利用所有真核基因的mRNA 的3’端都有一段多聚腺苷酸poly(A)尾结构的特点，将不同来源的总mRNA反转录合成cDNA,此cDNA 合成是采用oligo(dT)12MN 为引物，其中M为A,C,G中的任意一种，N为A,C,G 或T 中的任意一种，共有12 种oligo(dT)12MN 引物，其中M为锚定碱基可增大引物的Tm值，N 称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12 种引物分别对同一总mRNA 样品进行cDNA 合成，即进行12 次不同的反转录反应，得到12种类型的cDNA，从而也将总mRNA分为12 个亚群。在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和相