人类基因组计划的进展及基因克隆.docxVIP

人类基因组计划的进展及基因克隆 人类疾病筛查（hcg）的快速进展和一些生物多样性特征的建立，为人类提供了许多疾病信息。这不仅是人类探索生命秘密的点，也是人类后因组时代的一项更加挑战的任务。基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测定,后基因组学时代则是进行基因组功能注释(genome annotation),这也是功能基因组学的主要研究目标。但如何利用这些研究成果为人类服务,基因则是一个重要的资源。克隆化基因不仅可以用来兴旺生命科学工业(如制药业等),改良农作物、畜禽品种等,还可以对遗传性疾病进行基因治疗,探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。由于基因组计划要耗费大量人力、物力、财力,所以并非每一种生物都可以拿来测序,而且模式生物的基因有时并不能直接用于其它生物,因而克隆其它生物中对人类有益的基因也变得日益重要。随着基因专利权的建立和完善,基因争夺大战的硝烟日益弥漫全球,克隆基因似乎有着一本万利的诱惑力。在这样一个大环境下,克隆基因的技术也随着分子生物学发展的步伐而日臻完善和多样化。在传统遗传学(正向遗传学)占主导地位的时代,人们以基因产物为导向来分离克隆基因(功能克隆)。由于基因产物的结构、功能已知,可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列,反推其核苷酸序列,设计探针或引物从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选克隆(如玉米组蛋白脱乙酰酶HD2基因的分离),也可以制备产物抗体,从表达载体构建的cDNA文库中筛选相应克隆,进而分离目的基因。功能克隆受限于蛋白质的分离纯化技术,在大部分基因产物的结构功能未知的情况下,人们不得不从另外的角度去寻求突破。近年来,反向遗传学(reverse genetics)的建立,为分离未知产物的基因提供了越来越多的策略和思路。 1 bac或pac克隆测序检测dna片段中的序列分析和目的基因组学 随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越来越多的基因被定位,90年代初,图位克隆技术也应运而生。其基本工作思路为:首先将目的基因精确定位在分子标记连锁图上,利用与目的基因紧密连锁的标记筛选大片段DNA文库(如YAC、BAC、TAC、PAC或cosmid文库),并构建含目的基因区域的精细物理图谱,利用该物理图谱采用染色体步行(chromosome walking)的方法逐步逼近目的基因(如人的NPC1基因的克隆和拟南芥的WIGGUM基因的克隆)。若侧翼标记与目的基因连锁十分紧密或共分离,无需步移就可直接着陆,获得含目的基因的大片段克隆,再将大片段克隆作亚克隆分析或用大片段克隆作探针筛选cDNA文库,从而将目的基因确定于1个较小的DNA片段上,进一步作序列分析和目的基因功能鉴定。基因组DNA BAC或PAC克隆末端序列的分离是图位克隆中很重要的一步,Yang等利用BAC或PAC载体的特有酶切位点NotⅠ或SfiⅠ和BAC片段内的多酶切位点(EcoRⅴ、HpaⅠ、StuⅠ、XmnⅠ)进行双酶切,然后与质粒载体连接,进行锚定PCR来分离BAC的长末端序列,发展了一种高效快速的方法。图位克隆法首先被应用于模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana),1992年Giraudat等成功分离了与拟南芥种子形成和发芽相关的脱落酸信号传导基因ABI3,Arondel等则分离到拟南芥的ω-3脂肪酸脱饱和酶基因FAD3。由于抗性性状的遗传行为简单,表型易鉴定,而人的遗传性疾病也有这个特点且人类高密度的分子标记连锁图已建立,所以图位克隆技术在分离植物抗性基因和与人的遗传性疾病相关的基因上取得了很大的成功。如番茄抗霜霉病基因Pto、水稻抗白叶枯病基因Xa21、小麦抗线虫基因Cre3及200多个与人遗传性疾病相关基因的克隆等。 利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的基因组文库,建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系,而且还要进行大量的测序工作,所以对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采用此法不仅投资大,而且效率低。因而图位克隆法仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和生物上。随着比较基因组学的发展,人们意识到要充分利用图谱饱和生物的遗传信息服务于其它生物。我们可以利用同科异种间染色体共线性或同线性,通过比较基因组分析和染色体着陆,将控制该物种有关性状的基因或分子标记直接定位在它的分子标记连锁图中。如利用小麦与水稻基因组间的同线性,Sarma等将小麦控制开花时间的基因(Vrn)和控制谷粒硬度的基因(Ha)定位在第5组染色体上。通过大鼠与人的比较基因组分析,Scharf等定位了SMA的一个候选修饰基因H4F5。这些进展不仅为更快捷地克隆基因创造了条件,而且拓宽了图位克隆法的应用范围。已有人开始利用水稻的图谱信息筛选水稻小麦同线区的BAC或YAC,用于测序以搜索候选基因。而且随着越来越多的QTL被定位在分子标记连锁