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小麦抗叶锈近等基因系cr 0 基于生物活性的差异表达基因的分离和分析 [研究意义]小麦锈病是由小麦叶锈菌（purcsimatatima）引起的小麦叶锈病，是世界小麦疾病之一。也是影响小麦品质、产量和稳定的重要因素之一。应用抗病品种和提高小麦品种的抗病性,是防治小麦叶锈病的最基本和最经济有效的途径,而了解小麦抗叶锈病机制,将为培育高效广谱抗病品种、合理使用抗病资源提供重要依据。从基因表达整体水平上了解抗病相关基因表达的种类与数量,进而分析其相互关系,是进行抗病机制研究的有效方法。【前人研究进展】基于基因转录水平上差异表达的抗病机制的研究方法主要包括:m RNA差异表达技术(mRNA differentia display reverse transcription PCR,DDRT-PCR)、c DNA代表性差异分析(cDNA representationa difference analysis,cDNA-RDA)、差减杂交(subtractive hybridization,SH)、抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和c DNA-AFLP(complementary DNA amplified fragments length polymorphism)。不同的方法和技术具有各自的优缺点。cDNA-AFLP是Bachem等在AFLP(amplified fragment length polymorphism)的基础上发明的用于m RNA指纹图谱的技术,将RT-PCR和AFLP相结合,保留了AFLP多态性丰富、稳定性高、无需了解序列信息等优点,还集中显示了基因组表达序列的多态性差异;重复性好、准确可靠、效率高,可对生物体转录组进行全面、系统的分析;并且获得的转录衍生片段(transcript-derived fragments,TDF)一般也集中在蛋白编码区或者附近,可最大限度的提供基因编码区的信息。cDNA-AFLP所需的试验仪器设备比较简单,已经成为目前筛选差异表达基因最有效的方法之一。利用c DNA-AFLP可以方便地将不同组织或不同生理发育阶段差异表达的TDF分离出来。现在已经利用cDNA-AFLP在西红柿、马铃薯、水稻等植物中分离和克隆出多个有价值的基因,2003年,Zhang等利用该技术开展了小麦与小麦叶锈菌亲和互作的研究,揭示出亲和小麦中含有与剑蛋白(Katanin)和细胞增大蛋白相同源的基因。cDNA-AFLP自身的特点使其成为有效的分离差异表达基因的方法。在小麦叶锈病研究中,闫红飞等曾利用DDRT-PCR技术分析了TcLr38的初步的差异表达,获得一条425 bp的差异表达序列,高士刚等开展了6个小麦抗叶锈近等基因系cDNA-AFLP的分析,但只发现了TcLr38中24条可能与抗病相关的片段,而并没有对这些特异片段进行测序及详细分析,上述研究不能很好揭示Lr38的表达特性。【本研究切入点】小麦抗叶锈基因Lr38位于中间偃麦草(Agropyron intermedium)第7组的一条染色体上,并被标定在小麦的2AL上。该基因是在苗期即开始表达,且抗性很强,在中国至今很少发现对Lr38有毒性的菌株,具有较大的应用潜力。目前对于该基因的表达特性的研究尚无详细报道,明确该基因的表达特性、分析其抗病相关物质对于抗病基因的研究具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究以小麦抗叶锈近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher为材料,在河北农业大学分子植物病理学实验室建立小麦cDNA-AFLP技术体系和程序基础上加以改进,应用该技术研究TcLr38与小麦叶锈菌互作的mRNA表达的差异,旨在揭示小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的抗病相关基因,为深入研究其抗病机制奠定基础。 1 材料和方法 1.1 her的毒力基因 小麦抗叶锈病近等基因系TcLr38、感病对照Thatcher的种子和小麦叶锈菌种05-22-65(THTS,对TcLr38表现低毒力,对Thatcher表现高毒力)皆来自于河北农业大学小麦锈病研究中心。试验使用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。植物总RNA提取试剂购自天根生化科技(北京)有限公司,M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、DEPC(焦碳酸二乙酯)、Taq DNA聚合酶、PstⅠ、MseⅠ、dNTPs、ddH2O、琼脂糖及DL2000 Marker等购自上海Sangon和大连宝生物公司,聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒购自天为时代公司。 1.2 测试方法 1.2.1 总自然资源的提取与pta的合成 1.2.2 分辨率分析和avlp方法 试验采用cDNA-AFLP扩增体系和程序进行PCR扩增,扩增产物在5.