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实验五 肠道杆菌 n 示教： ¨ 主要肠道杆菌，大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌 及变形杆菌的形态、染色性 ¨ 主要肠道杆菌的培养特性： SS平板/EMB平板 ¨ 主要肠道杆菌的生化反应：双糖、尿素分解反应 Content Content n 操作： ¨ 肥达反应 ¨ 粪便肠道致病菌的分离和鉴定 ¨ 甘露醇发酵实验结果观察 ¨ 药敏试验结果观察 n 录像： 厌氧菌 n 肠道杆菌的分类 ETEC, EIEC, EPEC, EHEC, EAEC 痢疾、福氏、 鲍氏、宋内 伤寒，副伤寒， 猪 霍乱，肠炎 埃希菌属 志贺菌属 肠杆菌科 沙门菌属 克雷伯菌属 变形杆菌属 n 形态结构相似 n 培养要求不高 n 生化反应活跃 n 抗原结构复杂 n 抵抗力不强 n 易发生变异 肠道杆菌的基本特征 肥达试验 原理：用已知伤寒沙门菌O、H抗原，以及引起副伤 寒甲、乙杆菌H抗原的诊断菌液与受检血清作定量 凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效 价的试验。 用途：辅助诊断伤寒，副伤寒 肥达试验 n 病人血清中 的未知抗体 已知抗原 甲型副伤寒沙门 菌鞭毛H抗原 肖氏沙门菌鞭毛 H抗原 伤寒沙门菌菌 体O 抗原 伤寒沙门菌鞭 毛H抗原 凝集 原理： 血清1：20 0.2ml×4 0.8 ml 吸管吹打3次 1.6ml 生理盐水0.8 ml 混匀 0.8ml 混匀 生理盐水0.8 ml Ag加样方向 第二列小孔 …… …… 第一列小孔 0.2ml×4 0.8ml 混匀 生理盐水0.8 ml 2.加Ag 3.45℃孵育30’ 4.结果观察 测 Ab 未知 滴度 病人1：10血清 1 ：80 1 ：40 Ag 已知 1.稀释Ab SS 平板挑取可疑菌落2个 (无色,透明,小菌落) 接种双糖管 培养,观察 粪便标本肠道致病菌鉴别流程 鉴别培养基 (SS培养基) 生化反应 (双糖管) 血清学鉴定 标本 成分： ¨ 基础培养基、乳糖、枸橼酸钠、硫代硫酸钠、枸橼酸铁、胆盐、煌绿、 中性红( pH6.8-8.0，红 →橙黄) 作用： ¨ 乳糖，中性红 ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质 →菌 落淡黄色；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈红色。 ¨ 胆盐、枸橼酸钠、煌绿 ：抑制肠道非致病菌如E.coli的生长，对肠道 致病菌抑制作用弱。可增加标本接种量以提高肠道病原菌分离率。 n 病原菌:小,无色,透明 n 非致病菌:大,红色 SS平板—— 分离肠道病原菌的强选择培养基 EMB平板 病原菌:透明,无色 非致病菌:紫黑色 发酵乳糖 H2S试验 致病菌红色 非致病菌黄色 发酵葡萄糖(产酸产气)及动力 双糖管 指示剂:酚红(pH6.8-8.4, 黄 红) ▼ 观察： 下层：葡萄糖 半固体 上层：乳糖,Fe2+ 固体 乳糖 大肠埃希菌 ＋ 痢疾志贺菌 － 伤寒沙门菌 － 副伤寒沙门菌 － 变形杆菌 － 葡萄糖 + + 动力 + - + + + 硫化氢 - - +/- + + 尿素酶 - + 双糖管结果观察 可疑肠道致病菌 黄 色 黄 色 大肠埃希菌 黄 色 红 色 肥达试验 n 病人血清中 的未知抗体 已知抗原 甲型副伤寒沙门 菌鞭毛H抗原 肖氏沙门菌鞭毛 H抗原 伤寒沙门菌菌 体O 抗原 伤寒沙门菌鞭 毛H抗原 凝集 原理： n 凝集程度： (＋＋＋＋)上层液澄清，细菌全部凝集于孔底 (＋＋＋)上层液基本透明，细菌大部分( 75％)凝集于孔底 (＋＋)上层液半透明，细菌在孔底有明显凝集 (＋)上层液混浊，孔底有少量凝集 (－)不凝集，同于对照 ¨ 书写报告：＋＋反应的最高稀释度为凝集效价 肥达试验结果分析(1) ¨ 凝集效价：伤寒沙门菌O≥ 1：80，H≥ 1：160 副伤寒沙门菌H≥ 1：80 ¨ 动态观察：双份血清，效价≥4倍 ¨ O与H抗体的诊断意义： O— IgM, H— IgG 肥达试验结果分析(2) n O、H抗体均高： 肠热症 n O、H抗体均低：未患病 n O抗体不高， H抗体高：回忆反应，预防接种 n O抗体高， H抗体不高：感染早期，交叉反应 肥达试验结果分析(2) The End Thanks