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定点突变技术在生物药物研发中的应用 目前，随着工程技术、蛋白质工程、酶工程、细胞工程和发酵工程的快速发展，山羊工程、蛋白质工程、酶工程、，其中，蛋白质工程可以通过分子设计和dna重组技术合成自然界不存在的新性质或改造现有的蛋白质，引起人们的关注。蛋白质工程技术可为生物药物合成或改造提供设计方案,并通过有针对性的改造,使合成的重组蛋白药物的活性、稳定性、生物利用度、半衰期、免疫原性等得到改善。该技术在生物药物创新研究领域的应用价值日益凸显。本文对其中定点突变、体外定向进化和tRNA介导蛋白质工程技术在生物药物研发中的应用作一综述。 1 病毒前诱导的基因表达 定点突变(site-directed mutagenesis)技术是指在已知生物药物的结构和功能的基础上,有目的地改变其某一活性基团,或在已知DNA序列中取代、插入或删除特定长度的核苷酸片段,通过基因突变而改变生物大分子结构中的个别氨基酸残基,得到具有新性状的生物药物的方法,故又称理性分子设计。 定点突变技术需在获知生物药物的一级结构及编码序列的基础上,根据蛋白质空间结构来设计突变位点。与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比,该法具有突变率高、简单易行、重复性好的优点。此外,定点突变技术不仅可改变特定的核苷酸序列,而且可对一段最有可能影响生物功能和性质的核苷酸序列进行随机突变,从而产生一系列突变蛋白质,进而发现高活性或基因改良的生物药物。 纳豆激酶是由纳豆枯草杆菌产生的丝氨酸蛋白酶,具有很强的纤维蛋白溶解活性,是极具开发价值的潜在的心血管药物,但在实际应用中存在稳定性差、易氧化等缺陷。有研究表明:222位蛋氨酸(Met222)为该酶被H2O2氧化后失活的主要位点(Stadtman等,J Biol Chem,1969年)。一般来说,蛋白酶中暴露的Met残基较隐蔽残基更易氧化(Keck等,Anal Biochem,1996年),而野生型蛋白酶的易氧化性质与其Met222折叠后位于酶表面有关。为此,Weng等采用定点突变技术,将丝氨酸(Ser)和丙氨酸(Ala)引入纳豆激酶,分别替换催化残基Ser221附近的220位苏氨酸(Thr220)和Met222,筛选得到两个突变体T220S和M222A,并成功地在大肠杆菌中得到表达。抗氧化活性测试结果显示:纯化后的突变体M222A的抗氧化活性明显强于野生型酶,其对浓度为1.0 mol·L-1以上的H2O2也表现出抵抗性,而野生型酶在0.1 mol·L-1的H2O2作用下便失活;另一突变体T220S的抗氧化活性虽低于M222A,但较野生型酶有所提高,经浓度为1.0 mol·L-1的H2O2处理后仍保留40 %的残余活力。突变体T220S抗氧化活性提高的部分原因是,220位Thr替换为Ser后,使得Met222的空间结构发生了变化,致使原先位于表面易于氧化的Met222变成了一个隐蔽残基所致。 催化抗体也称抗体酶,是具有催化活性的免疫球蛋白,可参与水解、氧化还原和环加成等多种反应。对抗体酶10F11抗原结合片段进行的X-衍射结果显示,其催化活性可能与位于重链结合带底部H104的色氨酸(TrpH104)通过π叠加与底物的芳香环相互作用有关。Zheng等对参与逆狄尔斯-阿尔德反应的抗体酶10F11进行了定点突变,获得9个突变体,主要突变位点包括TrpH104、PheH101和SerH100。结果显示:在重链TrpH104和PheH101处进行突变而获得的突变体的催化活性最强;PheH101突变为LeuH101后,不但能提高抗体酶参与的逆狄尔斯-阿尔德反应的kcat/kuncat(催化常数/非催化常数)值,而且还间接地提高了该反应中过渡态与TrpH104的π叠加作用,从而提高了催化环加成的效率。 陈涛等采用巨引物PCR法介导的定点突变技术,将猪α-干扰素(poIFN-α)第86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC),并将其成熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变为大肠杆菌偏爱的密码子TGC,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEXIFN。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分析显示,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的20 %。同时,他们对以包涵体形式表达的目的蛋白进行变、复性处理,并以快速蛋白液相色谱法(FPLC)进一步纯化,得到具有较高生物活性(5 200 IU·mg-1)的poIFN-α。 Prion蛋白(PrP)中左手β螺线管折叠(LβH)结构错误折叠可能与其致病性有关,为了证实该假设,Choi等将已知具有经典LβH结构、源自大肠杆菌的尿苷-N-乙酰葡萄糖胺酰基转移酶(LpxA)作为研究对象,采用定点突变技术将其位于β-螺旋核心区的疏水残基进行突变,结果发现,在该残基第51- 62位处,微量的结构扰动都可导致出现一个新的功能表型,故将该位