腔肠动物中绿色荧光蛋白的性质和发射光谱的稳定性.docxVIP

腔肠动物中绿色荧光蛋白的性质和发射光谱的稳定性 1 gfp系绿色荧光蛋白 光是海洋无脊椎动物中常见的现象。由于机械性干扰，一些腔肠动物，如螺母、水蛭和祖母，可通过元件发射绿色荧光，并通过母方水域发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura等首先从多管水母(Aequoria victoria)中分离出一种分子量为20kD的称为Aequorin的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色,因此,人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。随后,人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP,其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae)和海紫罗兰科(Renillidae)的GFP,即AequoriaGFP和RenillaGFP。 2 gfp的理化性质、光学特性和改进 2.1 加标二聚体gfp 从水母体内分离到的GFP基因,长达2.6kD,由3个外显子组成,分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性,球状,可溶性天然荧光蛋白。AequoriaGFP分子量约27×103,一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽;而RenillaGFP是分子量为54kD的同型二聚体。两种GFP有不同的激发光谱,AequoriaGFP在395 nm具有最高光吸收峰,肩峰为473 nm;RenillaGFP在498 nm具有强烈的光吸收,肩峰为470 nm。两种GFP含有相同的生色团,发射光谱基本相同(λmax=508~509 nm)。 GFP性质极其稳定,易耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6 mol/L盐酸胍处理,一旦恢复中性环境,或去除变性剂,虽然变性的蛋白质并不能完全复性,但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是,它们在很大的pH范围内(pH7~12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。RenillaGFP的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定,不易变性。根据Sheen等的研究,GFP在受体内表达时,其稳定性并不亚于CAT蛋白,因而可以得到持续时间较长的荧光。 2.2 gfp的合成 GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠,在氧存在的条件下,使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65~67位的氨基酸残基(Ser-Tyr-Gly)环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮(4-p-hydroxybene-5-imidazolinone),形成生色团(基于组成生色团的元件不同,可将已知的GFP及其变种分为7种,每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助因子,在紫外或蓝光激发下就能发荧光,在450~490 nm蓝光激发下,GFP荧光至少能保持10 min以上,不像其他荧光素,荧光容易淬灭。其中,GFP的一个引人注目的特点,其生色团的形成没有物种的特异性,可以在翻译后2~4 h通过自动催化作用来合成。Cubitt等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成,由此Kolb等提出一个假说,即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。 2.3 gfp的荧光特性和应用优势 GFP的荧光性质比较特殊,具有诸多优点而备受关注。 (1) gfp激发后叶绿素荧光 GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子,只需紫外光或蓝光激发,即可发出绿色荧光,用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次,即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的,在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。 (2) 延长可探测时间 GFP对光漂白(一种荧光衰减现象)有较强的耐受性,能耐受长时间的光照,从而延长了可探测时间;GFP在pH7~12范围内也能正常发光,对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。 (3) 它对细胞没有毒性 从目前的研究结果来看,GFP对生活的细胞基本无毒害,与目的基因融合后,对目的基因的结构功能没有影响,转化后细胞仍可连续传代。 (4) 方便加载 由于编码GFP的基因序列很短,所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒,而不至于使质粒过大影响转化频率。 (5) 活细胞的实时定位观察 GFP是能在异源细胞内表达后,能自发产生荧光的蛋白,并且GFP的分子量较小,N-端和C-端都能忍受蛋白的融合,是理想的标记物,可进行活细胞实时定位观察,更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态,还可实时观察到外界信号刺激下,目的蛋白的变化过程,借助荧光显微镜观察,使研究更为方便。使用激光共聚焦显微