实验、大肠菌群的检验.pptx

实验 、大肠菌群的检验 实验目的 · 掌握鉴别大肠菌群的方法。 · 掌握以最大概率数法测定大肠菌群 数量的方法。 实验原理 大肠菌群指一群能发酵乳糖 、产酸 产气 、 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢 杆菌 。 该菌主要来源于人畜粪便 ， 以此作为 粪便污染指标来评价食品的卫生质量 ， 推断 食品有否被肠道致病菌污染。 食品中大肠菌群以100ml 检样内大 肠菌群最可能数（MPN） 表示。 实验设备 • 恒温培养箱：（36±1） ℃ • 显微镜 • 培养皿 • 试管 、移液管 、三角烧瓶 、 小倒管 • 天平 • 载玻片 实验试剂 · 乳糖胆盐发酵管： 20g蛋白胨 、5g 猪胆盐及10g乳糖 溶于1L水中 ， 校正pH为7 .4 ， 加25ml溴甲酚紫指 示液(0.4 g/L) ， 分装每管20 ml, 并放入一个小 倒管 ， 115℃高压灭菌20 min。 · 伊红美蓝琼脂平板： 10g蛋白陈 、2gK2HPO4及17g琼脂 溶解于1L水中 ， 校正pH至7. 1 ， 分装于锥形瓶内， 121℃高压灭菌15min 。 临用时加人10g乳糖并加 热溶化琼脂 ， 冷至50～55℃ 。加人20mL伊红溶 液（20g/L)和10ML美蓝溶液（6.5g/L） 摇匀 ， 倾 注平板。 · 乳糖发酵管： 将20 g蛋白陈和10g乳糖溶于1L水 中 ， 校正pH至7.4 ， 加入25mL溴甲酚紫指示液 (0.4g/L) ， 按检验要求分装 ， 并放人一个小倒 管 ， 加热至115℃高压灭菌15 min · 灭菌生理盐水： 0.9% · 革兰氏染色液： ①结晶紫染色液： 1g结晶紫溶于20mL95%乙醇 ， 与 80mL草酸铵溶液（ 10g/ L)混合 ， 摇匀。 ②革兰氏碘液： 1g碘与2g碘化钾混合后 ， 用少量水 溶解 ， 稀释至300 mL。 ③沙黄复染液： 0.25g沙黄溶于10ml95%乙醇中 ， 然 后用90ml水稀释 ， 混匀。 实验内容与步骤 1） 检样稀释（无菌操作） ①将25mL（或g） 检样置于含225mL灭菌生理盐水的 灭菌玻璃瓶 ， 充分振摇（固体检样用匀浆器 ， 用 8000 －10000r/min的速度处理1 min） 制成1： 10的 均匀稀释液。 ②用1mL灭菌吸管吸取1： 10稀释液1mL ， 注入含有 9mL灭菌生理盐水的试管内 ， 混匀 ， 制成1 ： 100 的稀释液。 ③另取1mL灭菌试管 ， 按②操作依次做10倍递增稀释 液 ， 每稀释一次 ， 换用一支1 mL灭菌试管。 2） 乳糖发酵实验 接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。 接种3个稀释度 ， 每一稀释度接种3管 ， 置 （36土1)℃温箱内培养（24士2) h 。 如所 有乳糖胆盐发酵管都不产气 ， 则可报告为 大肠杆菌群阴性 ， 如有产气者 ， 则按下列 程序进行。 3） 分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝 琼脂平板上 ， 置（36士1)℃恒温箱内培养 18一24 h 。取出 ， 观察菌落形态 ， 并做革 兰氏染色和证实试验。 4） 证实试验 在上述平板上 ， 挑取可疑大肠菌群菌落 1一2个进行革兰氏染色 ， 同时接种乳糖发 酵管 ， 置（36士1)℃恒温箱内培养（24士2) h ， 观察产气情况 。 凡乳糖产酸产气 、革 兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌 ， 即可报告 为大肠菌群阳性。 实验报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数， 查MPN检索表 ， 报告每100mL（或g） 大 肠菌群的MPN。 注： ①本表采用3个稀释度： 1ML (g) ， 0. 1mL (g） 和 0.01 mL (g) 。每稀释度3管。 ②表内所列检样量如改用10mL (g) ， 1mL (g） 和 0. 1mL (g） 时 ， 表内数字应相应降低10倍； 如 改用0. 1ML (g), 0.01ML (g） 和0.001mL (g） 时， 则表内数字应相应增加10倍 ， 其余可类推。 附1： 平板划线接种方法 1.斜线法 2. 曲线法 3.方格法 4.放射法 5. 四格法 附2： 革兰氏染色法操作步骤 1 、涂片： 取大肠杆菌制成涂片 ， 干燥 ， 固定。 2 、染色： 用草酸铵结晶紫染色1min ,用水冲洗。 3 、媒染： 滴加革兰氏碘液冲去残水 ， 并用碘液覆 盖1min ， 用水冲去碘液。 4 、 乙醇脱色： 斜置载玻片于一烧杯上 ， 滴加95% 乙醇 ， 并轻轻摇动载片 ， 至乙醇液不呈现紫色 时停止（约0.5min） 。立即用水冲净乙醇并用滤 纸轻轻吸干 。脱色是革兰氏染色的关键 ， 必须 严格掌握乙醇的脱色程度 。若脱色过度则阳性 菌被误染为阴性菌； 而脱色不够时阴性