血红蛋白的提取和分离.ppt

课题3 血红蛋白的提取和分离 主要内容： 一、基础知识 二、实验操作 本文档共40页；当前第1页；编辑于星期一\21点7分 一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法） 1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 2、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 3、原理： 本文档共40页；当前第2页；编辑于星期一\21点7分 4、具体过程 一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 本文档共40页；当前第3页；编辑于星期一\21点7分 本文档共40页；当前第4页；编辑于星期一\21点7分 分子量 大 小 直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面 小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部 运动方式 垂直向下移动 垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部 运动速度 较快 较慢 运动路径 较短 较长 洗脱次序 先从凝胶柱洗脱出来 后从凝胶柱洗脱出来 一、基础知识---蛋白质分离和提取的原理 本文档共40页；当前第5页；编辑于星期一\21点7分 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快 D 本文档共40页；当前第6页；编辑于星期一\21点7分 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 B 本文档共40页；当前第7页；编辑于星期一\21点7分 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 ㈡ 缓冲溶液： 2、作用： 能够抵制（ ）对溶液（ ）的影响，维持PH基本不变。 外界的酸或碱 pH值 本文档共40页；当前第8页；编辑于星期一\21点7分 3、缓冲溶液的配制 通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（ ）使用的缓冲液。 1－2 使用比例 在不同PH范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究其(活性) 4、在本课题中使用的缓冲液？ 本文档共40页；当前第9页；编辑于星期一\21点7分 （三） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 本文档共40页；当前第10页；编辑于星期一\21点7分 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 琼脂糖凝胶电泳示意图 本文档共40页；当前第11页；编辑于星期一\21点7分 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳 （1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N，—亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。 （2）原理： 本文档共40页；当前第12页；编辑于星期一\21点7分 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 （3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理: 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳 本文档共40页；当前第13页；编辑于星期一\21点7分 使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 本文档共40页；当前第14页；编辑于星期一\21点7分  蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂